柱前衍生RP-HPLC法测定16种氨基酸

赵红玲，高 杨，王小青，王良友，尹志峰（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

技术方法

柱前衍生RP-HPLC法测定16种氨基酸

赵红玲，高 杨，王小青，王良友，尹志峰
（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

柱前衍生；异硫氰酸苯酯；氨基酸；高效液相色谱法

氨基酸是自然界中一种重要的生命物质，作为蛋白质的基本组成单元，在动植物体内蛋白质和多肽的合成过程中起关键作用。有研究表明，某些氨基酸对动物体内多种生命活动起到调节作用，如营养物质的代谢、调控细胞的基因表达和信号转导等［1-2］。因此，氨基酸的分离、分析方法及应用逐渐引起人们的关注［3］。

近年来，随着色谱技术的发展，衍生色谱法开始应用于氨基酸的测定［4］。目前，应用较多的是柱前衍生-反相高效液相色谱法（RP-HPLC），该方法的原理是在特定条件下某衍生化试剂在色谱柱前与氨基酸发生化学反应，产生有利于色谱分离或检测的氨基酸衍生物［5］。

本研究以异硫氰酸苯酯（PITC）为柱前衍生化试剂，采用RP-HPLC法对16种氨基酸进行分析测定，为蛋白质或多肽类药物的氨基酸组成分析提供有效可行的测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC98-I AAA氨基酸分析仪、二元梯度泵、柱温箱、在线真空脱气机、紫外检测器（北京温分分析仪器技术开发有限公司）；浙大智达N2000色谱数据工作站；纯水器（力康生物医疗科技控股有限公司）；PHS-3C型酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；电子分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。

1.2 16种氨基酸标准品 中国药品生物制品检定所（批号：140624-200805）：包括天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）。

1.3 其它试剂 甲醇、乙腈（色谱纯试剂，天津科密欧化学试剂有限公司）；分析纯试剂包括：异硫氰酸苯酯（PITC，阿拉丁试剂），冰醋酸、正己烷（国药集团化学试剂有限公司），三乙胺（北京兴福精细化学研究所），无水醋酸钠（天津市博迪化工股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 氨基酸标准品溶液制备 精确称取16种氨基酸标准品各10μ mol，用0.1mol/L的盐酸溶液定容至10ml，配制溶度为1μ mol/ml的氨基酸混合对照品溶液，4℃冰箱储存备用。

2.2 柱前衍生化 精密量取氨基酸混合对照品溶液200μl，分别加入0.1mol/L的PITC乙腈溶液（0.12ml PITC用乙腈定容至10ml，摇匀）和1mol/L的三乙胺乙腈溶液（1.35ml三乙胺用乙腈定容至10ml，摇匀）各100μl，摇匀后室温静置1h，加入正己烷400μl，充分振摇，静置10min，吸取下层溶液100μl，用超纯水稀释5倍，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液10μl进样。

2.3 色谱分析条件 流动相A：无水醋酸钠8.2g用1000ml超纯水溶解，配制成0.1mol/L的醋酸钠溶液，用醋酸调至pH=6.5；流动相B：乙腈。色谱柱：Kromasil C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）；柱温：40℃；流速：1ml/min；检测波长：254nm。梯度洗脱程序见表1，色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序

图1 16种氨基酸标准品的HPLC谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1”项16种氨基酸混合对照品溶液，用0.1mol/L的盐酸溶液依次稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125μmol/ml，按“2.2”项的方法衍生化后分别进样分析。以氨基酸浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数及线性范围，结果见表2：

2.5 精密度试验 取“2.1”项氨基酸混合对照品溶液200μl，经衍生化后连续进样6次，测定各氨基酸的峰面积积分值。结果，16种氨基酸的峰面积对应的RSD均＜1.9%，表明仪器精密度良好。

3 讨论

分别考察Innoval C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），Accurasil C18色谱柱（4.6×250mm， 5μm），Venusil C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），Kromasil C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）对16种氨基酸的分离效果，结果Kromasil C18色谱柱的分离效果最佳。醋酸钠缓冲液的盐浓度会影响氨基酸的分离效果，研究发现，以0.1mol/L的醋酸钠溶液作为水相时，各个氨基酸得到了较好的分离。

衍生化试剂PITC对色谱柱有一定的损害，用正己烷萃取后可有效减少PITC的残留，同时在色谱柱前加保护柱，可以减少对色谱柱的损害，延长色谱柱的使用寿命。

本研究采用的柱前衍生RP-HPLC法测定氨基酸的方法具有准确、可靠、精密度高等特点，为进一步应用于蛋白质或多肽类药物的氨基酸组成分析提供了依据。

［1］叶元土，王永玲，蔡春芳，等.谷氨酰胺对草鱼肠道L-亮氨酸、L-脯氨酸吸收及肠道蛋白质合成的影响［J］.动物营养学报，2007，20（1）：28-32.

［2］Matte JJ，Lefloc HN，Primot Y，et al.Interaction between dietary tryptophan and pyridoxine on tryptophan metabolism，immune responses and growth performance in post-weaning pigs［J］. Animal Feed Science and Technology，2011，170（3）：256-264.

［3］Bhushan R， Bruckner H. Marfey's reagent for chiral amino acid analysis： A review［J］. Amino Acids，2004，27（3-4）：231-247.

［4］Roach MC，Harmony MD.Determination of amino acids at subfemtomole levels by high- performance liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection［J］. Anal Chem，1987，59（3）： 411-415.

［5］章丽，刘松雁.氨基酸测定方法的研究进展［J］.河北化工，2009，32（5）：27-29.

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1004-6879（2015）01-0051-03

2014-09-26）