活性污泥中氧化铁细菌的分离鉴定及酶活的初步研究

汪令翔,张翔宇,朱秀玲,朱翠萍,孔 芳(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

活性污泥中氧化铁细菌的分离鉴定及酶活的初步研究

汪令翔,张翔宇,朱秀玲,朱翠萍,孔 芳∗
(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

利用尿素培养基富集培养及CGY平板划线法,从污水处理厂采集的活性污泥中分离筛选得到一系列产氧化铁酶菌株,结合Winogradsky液体培养和摇瓶发酵进行产铁氧化酶菌株的复筛,从中筛选产铁氧化酶能力较高的目标菌株.该菌株经过菌落形态、镜检、生理生化试验及16Sr DNA基因序列的遗传分析构建系统进化树的建立,被鉴定为Pseudomonas rhizosphaerae,命名为GS8.对该菌株产铁氧化酶的酶活进行测定,结果表明,该菌株是一株具有较高铁氧化性的菌株,产铁氧化酶的最适温度和p H范围分别为30℃和6.5～7.5, K＋与Mg2＋离子对铁氧化酶活性有一定的激活作用,Pb2＋与Ag＋对铁氧化酶活性有一定的抑制作用,而以Zn2＋对铁氧化酶的抑制作用表现最强.假单胞菌GS8菌株在治理污水与给排水工程中生物除铁应用具有潜在的应用价值.

假单胞菌;铁氧化酶;筛选;鉴定

由氧化铁锰细菌产生的铁、锰氧化酶系是污水处理最重要的酶系之一[1-4],其中使用较多的氧化铁锰细菌包括浮游球衣菌属(Sphaerotilus)、披毛菌属(Gallionella)、纤发菌属(Leptothrix)、鞘细菌(Sheathed bacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、聚球藻属(Synechococcus)等[5-7],它们大多为化能自养菌,生长速率与代谢速率都很低,且产氧化酶系含量低,容易失活[8],因此,高效氧化铁锰菌种的筛选及其氧化特性的深入研究,仍然是生物除铁除锰技术开发利用的关键.假单胞菌属的大多为化能异养型或兼性异养型细菌,能够降解多种多样的有机物,生长迅速、环境适应能力强.据文献报道,该属的某些种属具有氧化铁的能力,可催化可溶性的Fe2＋氧化成Fe(OH)3,用于处理含铁废水,经沉淀过滤从水中除去,达到净化水质的目的[9].从污水处理厂的活性污泥中就具有铁氧化性细菌进行快速筛选,对筛选的目的菌株进行形态特征、生理生化特征与分类学鉴定,并对其产铁氧化酶条件进行探讨,为该菌应用于污水生物除铁提供了参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

生活污水混合液2份,活性污泥混合液2份,取自安徽芜湖污水处理厂.

1.2 培养基

富集培养基.尿素培养基(g·L－1):尿素0.5,葡萄糖1.0,MgSO4·7H2O 0.05,K2HPO40.1,p H自然.

分离纯化培养基.Stoke培养基(g·L－1):葡萄糖1.0,蛋白胨1.0,MgSO4·7 H2O 0.2,CaCl20.05, FeCl30.01,p H 7.0,琼脂20;CGY分离纯化培养基(g·L－1):蛋白胨5.0,酵母膏1.0,甘油10.0,p H 7.0,琼脂20.

初筛培养基.Winogradsky铁细菌培养基(g·L－1):NH4NO30.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,Na NO30.5,CaCl2·6 H2O 0.2,柠檬酸铁铵10.0,p H自然.

复筛培养基(基础产酶培养基).Fe2＋培养基(g·L－1):(NH4)2SO40.5,K2HPO40.5,NaNO30.5, MgSO4·7H2O 0.5,CaCl2·6 H2O 0.1,柠檬酸铁铵10.0,p H 7.0.

1.3 方法

(1)富集培养及菌株的分离纯化.吸取0.5 m L污水水样接种于4.5 m L尿素培养基中进行富集,28℃静置培养,每隔24 h检查液体培养基是否变浑浊,如有则更换到新鲜培养基中反复富集3～4次,然后再在Stoke固体平板中多次划线纯化,挑取分离出的单菌落接种于CGY培养基中保存.

(2)初筛与复筛.将在Stoke平板中分离纯化的单菌落接到Winogradsky液体培养基中进行初筛, 28℃恒温培养,每隔12 h观察培养基中是否有红褐色沉淀产生,选择沉淀时间短且沉淀程度好的菌株再进行下一轮的复筛.将初筛出的菌株接入CGY液体培养基中,28℃培养3 d进行活化,然后配制菌悬液浓度为106～107CFU/m L,以2%接种量接入50 m L基础产酶培养基中进行复筛,28℃恒温150 r/min震荡培养3 d,将发酵液5 000 r/min离心10 min,除弃菌体及不溶物,收集上清液以测定铁氧化酶的活性.

(3)铁氧化酶活力的测定.改良TMPD法[10],吸取粗酶液5 m L,加入FeSO4至200 mg/L,30℃静置反应30 min,将沉淀物去除,然后按邻啡啉法进行,在OD600时测定培养基中铁氧化酶活性.

式中,OD平均值为3个平行测定值的均值;OD空白组为未接菌种的测定值.由于目前该酶酶活尚无明确规定,故本实验中规定测量组中氧化率最高者的相对酶活为100%.铁氧化酶活性是以该酶对Fe2＋的氧化率来表示,氧化率越高表明酶活性越高.

(4)菌株的培养特征及生理生化特征实验.根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》[11-12]对菌株生理生化进行鉴定.

(5)16S r DNA基因序列的测定与进化树的构建.采用细菌通用引物27F/1492R进行扩增.PCR反应条件为:96℃3 min;96℃30 sec,53℃45 sec,72℃1 min,循环30次;延伸10 min,扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,全序列的测定提交上海生工生物公司完成.

序列与NCBI网站GenBank中的已知序列进行Blast.采用MAGE4.0软件中Bootstrap Test of Phylogeny的N-J算法(BootStrap的设定值为1000)构建系统进化树.

(6)菌株产铁氧化酶的酶学特性研究.接1.3(2)方法制备铁氧化酶粗酶液,将发酵液于4℃离心10 min,收集上清液作为粗酶液备用.

①温度对铁氧化酶酶活的影响.收集5 m L上清液在不同温度25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下保持30 min,测定发酵液中的酶活.

②p H对铁氧化酶酶活的影响.收集的上清液用HCL或NaOH将发酵液的p H分别调节为5.5、6、6.5、7、7.5、8.0、8.5,室温保持30 min,测定发酵液的酶活.

③金属离子对铁氧化酶酶活的影响.收集5 m L上清液添加不同金属离子溶液,取NaCl、KCl、MgCl2、ZnCl2、CuCl2、Pb NO3、Ag NO3溶液,调节金属离子终浓度达到5 mmol/L,室温保持30 min,测定发酵液的酶活.

2 结果与分析

2.1 富集与分离纯化

通过尿素培养基的反复富集及Stoke平板多次划线纯化分离,成功从4份不同来源的样品中纯化分离出15株菌株.将15株菌株接种于Winogradsky液体培养基进行初筛,由于Winogradsky液体培养基中含有柠檬酸铁铵的成分,能产生铁氧化酶的菌株可将Fe2＋氧化生成红褐色的Fe(OH)3沉淀,然后根据沉淀出现的时间及沉淀变化的程度,定性判断可产生铁氧化酶的菌株,从而在15份菌株中筛选出GS1、GS3、GS6、GS7、GS8、GS11、GS12共7株菌株.

2.2 高效氧化铁菌株的复筛

将初筛的7个菌株接种于复筛基础产酶培养基中,28℃恒温振荡培养3 d,测定发酵液的铁氧化率与相对酶活,结果如图1所示.由图1可知,以菌株对Fe2＋氧化率的大小作为菌株产铁氧化酶活力高低的评价,不同菌株所产的铁氧化酶酶活力有一定的差异,由高到低排列为GS8＞GS11＞GS1＞GS12＞GS7＞GS3＞GS6,其中,菌株GS8的铁氧化率可达57.5%.设定铁氧化率最高菌株GS8的相对酶活为100%,其余菌株酶活跟其比值表示各菌株的相对酶活,菌株GS8、GS11、GS1、GS12的相对酶活均达到60%,下面实验选择相对酶活最高的GS8菌株.

2.3 菌株GS8的初步鉴定

(1)菌株GS8菌落形态特征.菌株GS8在Stoke固体平板上培养2 d,形成白色隆起、无光泽、边缘不规则的粗糙型菌落;在CGY固体平板上,形成隆起明显增大菌苔厚实、淡黄色圆形突起、边缘整齐的湿润光滑型菌落;在Winogradsky铁细菌培养基上形成圆型隆起、红褐色带金属光泽的菌落,如图2所示.由图2d可知,细菌革兰氏染色镜检显示单个细胞呈杆状,该菌株为革兰氏阴性菌,不产芽孢.

(2)菌株GS8液体培养特征.菌株GS8在CGY液体培养基中,静止培养24 h开始形成菌膜,72 h后菌膜增厚,摇动不易破裂;在Winogradsky液体培养基中Fe2＋可被氧化生成红褐色的Fe(OH)3沉淀,如图3a、图3b所示.

(3)生理生化特征.菌株GS8的生理生化反应试验结果如表1所示.由表1可知,该菌株可能会产生硝酸盐还原酶与过氧化氢酶,可被酒石酸盐与柠檬酸盐利用,并呈阳性反应;在Winogradsky固体平板上形成红褐色金属光泽的菌落,这与该菌株体内存在较强的铁氧化酶系有关;甲基红反应为阳性;菌株有微弱的明胶液化能力;V.P测定为阴性反应;可分解葡萄糖产生有机酸但不产气.

表1 菌株GS8的生理生化反应

(4)菌株GS8遗传进化树的分析.以菌株GS8基因组DNA为模板进行菌株16Sr DNA PCR扩增, PCR电泳图如图4所示.将产物提交给上海生工测定序列全长,得知该扩增产物大小约为1 535 bp,将该序列与GenBank数据库中进行BLAST比对,结果发现菌株序列与假单胞菌属的菌种同源性很高,如Pseudomonas rhizosphaerae、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)等的16Sr DNA基因序列具有高度同源性.按相似度高低选取相关的假单胞菌属菌株18株进行系统发育分析,系统发育树如图5所示.用MEGA4软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树可以看出,其中菌株GS8与Pseudomonas rhizosphaerae(Genebank登录号为AY152673)聚类并在同一分支, BLAST比对1535bp长度上二者同源性为99%,结合形态和培养特征、生理生化特征方面,菌株GS8可鉴定为假单胞菌属,并且与Pseudomonas rhizosphaerae具有高度相似性.

2.4 菌株GS8产铁氧化酶的酶学特性

(1)温度对酶活力的影响.将酶液在不同温度下保温,铁氧化酶的活力如图6所示.由图6可知,菌株GS8对温度变化较为敏感,在温度变化不太明显条件下,酶活力变化较大.产铁氧化酶的活性随着温度的升高呈先增后陡降的趋势,产酶最适温度为30℃.当铁氧化酶在温度30℃时处理30 min,其氧化率仍可达54.6%,当温度在55℃时氧化率只有10.5%,可见高温对酶活力的影响较为显著.

(2)p H对酶活力的影响.设置p H为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,p H对铁氧化酶的影响如图7所示.由图7可知,菌株GS8的铁氧化酶的活性随p H从偏酸到偏碱呈先升后降的趋势,铁氧化酶的稳定p H范围是偏中性的6.5～7.5,铁氧化酶在p H 7.0时放置30 min,其氧化率仍可达52.4%.

(3)金属离子对产酶的影响.金属离子对铁氧化酶的影响如图8所示.由图8可知,不同金属离子对菌株GS8产铁氧化酶的活性影响差异较大,以不加任何金属离子的酶液相对酶活为100%作对照,其中对铁氧化酶活性激活作用最好的为K＋与Mg2＋,这两种离子的相对酶活和相对CK均约有118%以上,并且其铁氧化率分别是52.2%与50%,均比空白对照(CK)42.5%高;其次是Na2＋也有较好的激活作用,相对酶活为105%,铁氧化率达44.8%;Cu2＋的影响不明显,相对酶活为95%,作用与CK相当;Pb2＋与Ag＋对铁氧化酶活性有一定的抑制作用,而以Zn2＋对铁氧化酶的抑制作用最强.

3 结论

Fe2＋氧化酶是氧化铁离子的主要活性因子,是微生物细菌在污水处理中的主要酶系,对菌株最适产酶条件的研究结果对该酶在给排水工程中的应用具有一定的参考价值.从芜湖污水处理厂的样品中分离筛选得到一株具有较强铁氧化活性的菌株GS8,对该菌株进行分类学鉴定,确定该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas),并且与Pseudomonas rhizosphaerae具有高度相似性.由于在对菌种GS8的纯化分离过程中,可能污水中存在球衣菌属(Sphaerotilus)氧化铁鞘细菌(sheathed bacteria),导致在前期富集培养筛选的GS8菌株中可能仍有较少鞘细菌的干扰.

培养条件对菌株GS8产生铁氧化酶有较大的影响,该菌株所产铁氧化酶的最适温度和p H范围分别为30℃和6.5～7.5,K＋与Mg2＋离子对铁氧化酶活性有一定的激活作用,而Zn2＋对该菌株的铁氧化酶的酶活性具有强抑制作用.假单胞菌GS8的鉴定以及产铁氧化酶的最适温度、最适p H值、金属离子稳定性的研究,对酶的分离纯化与活性保护具有一定的指导意义.

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Study on the isolation and enzyme characteristic of iron-oxidizing bacterium from activated sludge

WANG Ling-xiang,ZHANG Xiang-yu,ZHU Xiu-ling,ZHU Cui-ping,KONG Fang∗
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

A series of Ferro-oxidase producing strains were screened from the activated sludges by enrichment cultures and CGY streak plate methods.The strain which could produce oxidizing enzyme with the highest activity was rapidly selected by Winogradsky liquid tube methods and flask methods.The strain was identified according to morphological features,physiological and biochemical analysis as well as 16Sr DNA gene sequence analysis.The strain identified as Pseudomonas rhizosphaerae was named GS8.The strain has a potential application in sewage treatment.The optimum temperature and p H value range of Ferro-oxidase were 30℃and 6.5～7.5 respectively.K＋and Mg2＋could activate Ferrooxidase, whereas Pb2＋and Ag＋had only modest inhibitory effect,While Zn2＋could strongly inhibit Ferro-Oxidase.Strain GS8 has a potential application potential in sewage treatment.

Pseudomonas;Ferro-oxidase;screening;sewage treatment

X172

A

1672-2477(2015)05-0013-06

2015-09-18

国家大学生创新创业训练计划基金资助项目(201410363067);安徽省大学生创新创业训练计划基金资助项目(AH201410363067)

汪令翔(1992-),男,安徽潜山人,本科.

孔 芳(1973-),女,湖北随州人,副教授,博士.

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