红曲霉发酵农副产品过程中多酶特性的初步研究

蒋 汶,汤文晶,郑天柱,谭 胜,张庆庆(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

红曲霉发酵农副产品过程中多酶特性的初步研究

蒋 汶,汤文晶,郑天柱,谭 胜,张庆庆∗
(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

以大米粉、麸皮、豆渣等常见的农副产品作为主要的营养基质,通过正交实验确定了最佳培养基配比.红曲霉菌株ZL307淀粉酶酶活在2 d时达到其最高值163.327 5 U/m L;蛋白酶酶活在3 d时达到其最高值92.2498 U/m L;酯化酶酶活在7 d时达到最高值16.672 5 U/m L;纤维素酶酶活在8 d时达到最高值,滤纸酶酶活可达0.132 2 U/m L,内切酶酶活可达0.333 1 U/m L,外切酶酶活可达0.134 7 U/m L,β-葡萄糖苷酶酶活可达0.153 8 U/m L.4种酶对温度的耐受性为纤维素酶＞淀粉酶＞蛋白酶＞酯化酶.4种酶对p H的耐受性为纤维素酶＞蛋白酶＞淀粉酶＞酯化酶.

红曲霉;液态发酵;多酶特性;正交优化

红曲霉在我国具有悠久的生产和使用历史[1],具有较高的药用价值,同时也可用于酿酒、制醋[2].红曲霉能产生多种酶类,主要包括淀粉酶、蛋白酶、酯化酶[3]以及纤维素酶等,产酶的类型及产量会因菌株种类不同而具有较大的差异[4].麸皮作为面粉加工副产物,综合利用率还不到20%,未能进行广泛的深加工,极少部分用于发酵辅料[5].豆渣是豆制品生产的主要副产物,由于纤维含量高、纤维颗粒大、口感粗糙、豆腥味很浓[6]等因素,对其作为饲料利用造成了一定影响.而目前关于以红曲霉为农副产品的主要发酵基质,并对其多酶特性的研究较少.

以安徽工程大学实验室保存的一株红曲霉菌株ZL307为实验菌种,利用大米粉、麸皮、豆渣等常见的农副产品作为主要的液态发酵营养基质,对红曲霉产淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、纤维素酶的产酶条件以及4种酶对温度、p H的耐受性进行了研究.

1 材料与方法

1.1 菌种

红曲霉ZL307(Monascus ZL307),由安徽工程大学307实验室保藏.

1.2 试剂

麸皮、豆渣、大米粉,市售.

福林试剂(Folin试剂);磷酸盐缓冲液(p H 7.2);2%酪蛋白溶液;柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(p H 5.0); 2%可溶性淀粉溶液;3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂(农业部标准);磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(p H 4.6、p H 5.0);1%羧甲基纤维素钠CMC-Na盐溶液(p H 4.8);1%水杨素溶液(p H 4.8);1%微晶纤维素溶液.其他试剂均为国药分析纯.

1.3 培养基

(1)斜面培养基(g/L):马铃薯200,蔗糖20,水1 000 m L,琼脂5-20,p H自然,30℃恒温培养7 d.

(2)种子培养基(g/L):葡萄糖6,蛋白胨0.5,硫酸镁0.1,磷酸二氢钾0.25,硝酸钠0.3,水100 m L, p H 6.0,在30℃,180 r/min条件下培养3 d.

(3)初始发酵培养基:大米粉45 g,麸皮35 g,豆渣10 g,硫酸镁0.5 g,磷酸氢二钾1 g,吐温80 1 m L,水1 000 m L,p H 6.0,在30℃,180 r/min恒温振荡培养14 d.

1.4 仪器

BS-IEA振荡培养箱(国华电器有限公司);TD5Z台式低速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);L5紫外分光光度计(上海精科仪器有限公司);FC104电子天平(上海精科仪器有限公司).

1.5 生物量的测定

取10 m L发酵液,用多层纱布过滤,再用蒸馏水洗涤2～3次,拧干水分,在60℃烘箱中烘干至恒重,即为菌丝干重.

1.6 培养基的优化

通过单因素实验,在初始发酵培养基基础上确定最佳培养基配方.在前述单因素实验的基础上,选取大米粉添加量、麸皮添加量、豆渣添加量3个因素进行正交实验,正交因素水平如表1所示.

表1 3因素3水平L9(33)正交试验因素表

1.7 粗酶液制备

从摇瓶中取发酵液,3 800 r/min条件下离心20 min,上清液即为粗酶液.

1.8 淀粉酶的测定[7]

将2%可溶性淀粉溶液1.0 m L加入25 m L具塞比色管中,添加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(p H 5.0) 2 m L,40℃预热10 min,加入1.0 m L适当稀释的粗酶液,在40℃恒温振荡(160 r/min)反应1 h后,加入DNS试剂2 m L终止反应.摇匀,置沸水浴中煮沸5 min,立即冷却,加蒸馏水定容至10 m L.以加入经过高温灭活的酶液管作为调零点,在波长540 nm处比色测定吸光度值.与标准曲线对照计算得到酶活.每24 h测定一次酶活,平行测定3次取平均值.1 m L粗酶液在40℃、p H 5.0条件下,1 h内酶解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖定义为一个酶活力单位U/m L.

1.9 蛋白酶的测定[8]

在25 m L具塞比色管内加入适当稀释的粗酶液1 m L,置于40℃水浴中预热2 min,再加入经同样预热的2%的酪蛋白溶液1 m L,精确保温10 min,加入0.4 mol/L三氯乙酸2 m L以终止反应,继续置于水浴中保温20 min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤.取上清液1 m L,加0.4 mol/L的碳酸钠溶液5 m L,1 m L福林酚试剂,放入40℃恒温水浴中保温发色20 min后进行OD值测定.空白对照管试验测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 m L,使酶失活,再加入酪蛋白.在波长660 nm处测吸光度,根据标准曲线推算出蛋白酶的酶活.每24 h测量一次酶活,平行测定3次取平均值.37℃下每m L发酵液在1 min内水解酪蛋白生成1 ug酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位U/m L.

1.10 酯化酶的测定[9]

在50m L的锥形瓶加入10 m L环己烷,4 m L无水乙醇,2 m L己酸,0.96 g无水NaSO4以及0.2 m L粗酶液,取上清液0.5 m L于100 m L的锥形瓶中,加入5 m L水,2滴酚酞指示剂,用0.05 mol/L的NaOH滴定至终点,记录NaOH的消耗量V1,35℃的恒温反应24 h后,再取上清液0.5 m L测定NaOH的消耗量V2,进而推算出酯化酶酶活.35℃下1 h消耗1 umol己酸所需的酶量为一个酶活力单位U/m L.每隔24 h测定一次酶活,平行测定3次取平均值.

1.11 纤维素酶的测定

1 m L粗酶液在温度为50℃、p H为4.8条件下反应1 min,产生1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位U/m L.

(1)滤纸酶活力(FPA)的测定[10-11].在比色管底部加入一张(约1×3 cm,50±1.0 mg)烘干至恒重的M状新华滤纸和0.5 m L酶液,加入p H 4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5 m L,在50℃水浴保温60 min,冷却至室温,加入DNS试剂3.0 m L,于沸水浴中显色5 min.取出,冷却至室温后,加水定容至20 m L,于520 nm处测吸光值,折算成酶活单位U/m L.

(2)纤维素内切酶活力(CMC酶)的测定[10-11].在比色管中加入0.5 m L酶液和羧甲基纤维素钠(CMCNa)溶液1.5 m L,在50℃水浴保温30 min,加入10%氢氧化钠溶液2 m L,冷却至室温.加入DNS试剂3.0 m L,再于沸水浴中显色5 min.取出,冷却至室温后,加水定容至20 m L,于520 nm处测吸光值,折算成酶活单位U/m L.

(3)纤维素外切酶活力的测定[11-12].在比色管中加入1%的微晶纤维素溶液0.5 m L和0.5 m L酶液,置于温度为30℃、转速为200 r/min的震荡培养箱中反应20 h,冷却至室温,加入DNS试剂3.0 m L,于沸水浴中显色5 min.冷却至室温后,加水定容至20 m L,于520 nm处测吸光值,折算成酶活单位U/m L.

(4)β-葡萄糖苷酶活力的测定[11-12].在比色管中加入1%的水杨素溶液1.0 m L和1.0 m L适当稀释的酶液,置于温度为50℃的水浴保温30 min,冷却至室温,加入DNS试剂3.0 m L,于沸水浴中显色5 min.取出,冷却至室温后,用水定容至20 m L,于520 nm处测吸光值,折算成酶活单位U/m L.

1.12 温度对红曲霉产酶的影响

改变红曲霉的培养温度,分别设定为29℃、31℃、33℃、35℃、37℃下培养,其他条件不变,培养8 d时测定4种酶的酶活,其中纤维素酶测定内切酶酶活.

1.13 温度对红曲霉产酶的影响

改变红曲霉的培养基初始p H,分别设定为4.5、5、6、6.5、7,其他条件不变,培养8 d时测定4种酶的酶活,其中纤维素酶测定内切酶酶活.

2 结果与分析

2.1 培养基的优化

在初始发酵培养基的基础上,采用单因素实验方法,根据生物量为主要指标,以大米粉、麸皮为碳源因素,以豆渣为氮源因素,确定了红曲霉ZL307最佳培养基配比.

(1)大米粉添加量对生物量的影响.改变大米粉添加量,其他条件依照初始发酵培养基,测定发酵第8 d的生物量.大米粉添加量对生物量的影响如图1所示.由图1可知,当大米粉的添加量由50 g/L升高至55 g/L时,生物量由30.297 4 g/L变为30.298 8 g/L,仅增加了0.004 6%,大米粉添加量继续增加并不能促进红曲霉的生长,结合经济节约的原则,确定大米粉最佳的添加量为50 g/L.

(2)麸皮添加量对生物量的影响.选取大米粉添加量为50 g/L,改变麸皮的添加量,其他条件依照初始发酵培养基,测定发酵第8 d的生物量.麸皮添加量对生物量的影响如图2所示.由图2可知,当麸皮的添加量由35 g/L逐渐增加至50 g/L时,生物量由27.986 7 g/L增加至32.566 4 g/L,继续增加麸皮会抑制红曲霉的生长,因此,确定麸皮最佳的添加量为50 g/L.

(3)豆渣添加量对生物量的影响.选取大米粉添加量为50 g/L,麸皮添加量45 g/L,改变豆渣的添加量,其他条件依照初始发酵培养基,测定发酵第8 d的生物量.豆渣添加量对生物量的影响如图3所示.由图3可知,当豆渣的添加量由5 g/L逐渐增加至15 g/L时,生物量由29.289 3 g/L增加至33.697 5 g/L,继续增加豆渣对红曲霉的生长影响不大,因此,确定豆渣最佳的添加量为15 g/L.

(4)培养基的正交优化.按表1设计的实验结果进行实验,实验结果如表2所示.由表2可知,表中各因素对红曲霉生物量影响程度的大小依次为:A＞C＞B,即大米粉添加量＞豆渣添加量＞麸皮添加量,直观分析得出最佳培养条件为:A2B2C2,即大米粉添加量50 g/L,麸皮添加量50 g/L,豆渣添加量15 g/L.方差分析如表3所示.由表3可知,3种因素对红曲霉生物量影响的显著性由大到小依次为:大米粉添加量影响极显著,豆渣添加量影响显著,麸皮添加量影响不显著.

表2 正交实验数据

表3 方差分析表

2.2 红曲霉生长曲线与残糖曲线的测定与分析

红曲霉生长曲线与残糖曲线如图4所示.由图4可知,红曲霉的生长曲线呈S型.0～1 d,红曲霉处于迟滞期,生物量增加缓慢,红曲霉产生的大量酶系使得残糖量迅速升高;1～4 d,红曲霉处于对数生长期,生物量迅速增加,培养基中的残糖量也开始迅速下降;4～8 d,红曲霉增长速度放缓,但仍然有所增加,同时残糖量小幅度回升;至8 d后,红曲霉处于稳定期,生物量保持基本稳定,培养基中的残糖量开始缓慢下降,生物量达33.697 5 g/L.由于培养基中含有两种碳源,即大米粉和麸皮,红曲霉优先利用大米粉生长,待大米粉消耗完毕,红曲霉开始大量产生分解麸皮的酶系以满足自身生长的需要,这与生长曲线与残糖曲线所反映的信息相符合.

2.3 红曲霉发酵农副产品过程中桔霉素的检测

桔霉素标准品与红曲霉发酵样品液相色谱图如图5所示.图5a为红曲样品中桔霉素标准的液相色谱图,图5b为红曲霉发酵样品液相色谱图.对照谱图分析可知,红曲霉ZL307在发酵培养过程中不产生桔霉素.同时,前期的研究表明,该红曲霉菌株在发酵培养过程中可产生红曲色素[13]、Monacolin K[14]、γ-氨基丁酸[15]等活性物质,对于实际生产应用具有一定的价值.

2.4 红曲霉产淀粉酶与纤维素酶的测定与分析

红曲霉产淀粉酶与纤维素酶酶活曲线如图6所示.由图6可知,发酵初期0～2 d,由于培养基中存在着大米粉,红曲霉大量合成淀粉酶,酶活迅速升高;发酵中期2～5 d,淀粉酶活在2 d达到最高值163.327 5 U/m L后,由于培养基的淀粉被迅速消耗,酶活开始出现波动,缓慢下降,直至第8 d降至最低值;发酵后期9～14 d,培养基中的淀粉已经基本消耗殆尽,红曲霉的淀粉酶活维持在最低点保持稳定.

由图6还可以看出,在3 d时才开始测得极为微弱的4种纤维素酶活;3～5 d时,酶活开始迅速增长,此时红曲霉处于稳定期;5～6 d时,培养基中的淀粉逐渐消耗殆尽,酶活增长速度放缓;6～8 d时红曲霉开始大量产生纤维素酶以充分利用培养基中的麸皮,酶活在第8 d时达到最高值;8～11 d时产酶趋于稳定; 11 d后由于培养基中碳源的逐渐消耗,酶活呈直线下降.同时可以得出,红曲霉ZL307可以产生3种纤维素酶,即内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶.

通过上述的结果,对比红曲霉生长曲线与培养基中的残糖曲线可以看出,在红曲霉生长前3 d,其生长所需要的碳源主要由其产生的淀粉酶分解大米粉得到,至3～5 d由于大米粉逐渐消耗,红曲霉开始产生纤维素酶分解麸皮以满足生长的需要,因此培养基中的残糖量出现小幅波动,但红曲霉所产生的纤维素酶酶活较低,降解麸皮所产生的糖不能满足其生长需要,残糖含量逐渐降低,至8 d后红曲霉生长处于稳定期,因此残糖量保持稳定.综上所述,红曲霉的生长曲线、培养基的残糖曲线、淀粉酶酶活曲线与纤维素酶活曲线所表现出来的趋势是一致的.

2.5 红曲霉产蛋白酶的测定与分析

红曲霉产蛋白酶酶活曲线如图7所示.由图7可以看出,发酵初期0～3 d,红曲霉为了适应新的培养环境,大量合成蛋白酶,酶活迅速升高,于3 d达到最高值92.249 8 U/m L;发酵中期3～11 d,随着培养基中的氮源迅速消耗,酶活呈快速直线下降的趋势,于10 d降至最低点;发酵后期11～14 d,红曲霉的生长状态保持稳定,由于氮源的缓慢消耗,蛋白酶活基本保持稳定.由此可知,红曲霉产蛋白酶酶活曲线与红曲霉的生长曲线所表现出来的趋势是基本一致的.

2.6 红曲霉产酯化酶的测定与分析

红曲霉产酯化酶酶活曲线如图8所示.由图8可以看出,发酵初期0～3 d,红曲霉酯化酶产生的很少;发酵中期3～7 d,为了适应新的培养环境,红曲霉快速大量合成酯化酶,第7 d时达到最大值16.672 5 U/m L;7～11 d,酯化酶酶活保持相对稳定;随着发酵周期的延长,11～14 d,培养基中的营养物质逐渐减少,酶活稳定下降.

2.7 温度对红曲霉产酶的影响

温度对红曲霉产酶的影响如图9所示.由图9可知,4种酶的最适产酶温度有一定不同,且其对温度的耐受性也有所区别.红曲霉淀粉酶的产酶最适温度为33℃,37℃时其酶活下降44.58%.纤维素酶最适产酶温度为31℃,37℃时其酶活下降37.73%.蛋白酶对温度十分敏感,产酶最适温度为33℃,温度升高至37℃时,其酶活下降78.99%.酯化酶产酶最适温度为31℃,其对温度也特别敏感,37℃时其酶活下降81.08%.由此可知,4种酶对温度的耐受性为纤维素酶＞淀粉酶＞蛋白酶＞酯化酶.

2.8 p H对红曲霉产酶的影响

p H对红曲霉产酶的影响如图10所示.由图10可知,4种酶的最适产酶p H有一定不同,且其对p H的耐受性也有所区别.红曲霉淀粉酶的最适产酶p H为6.5, p H为4.5时酶活最低,其酶活下降48.87%.纤维素酶最适产酶p H为5.5,p H为7时酶活最低,其酶活下降38.44%.蛋白酶产酶最适p H为6,p H为4.5时酶活最低,其酶活下降40.66%.酯化酶产酶最适温度p H为5.5,p H为4.5时酶活最低,其酶活下降57.12%.由此可知,4种酶对p H的耐受性为纤维素酶＞蛋白酶＞淀粉酶＞酯化酶.

3 结论

红曲霉菌株ZL307在含有大米粉、麸皮、豆渣等农副产品的发酵培养基上培养时,其最佳培养基配方为大米粉50 g/L、麸皮50 g/L、豆渣15 g/L,生物量在发酵8 d时达到最高,可以达到33.697 5 g/L.在此培养基上培养时,红曲霉ZL307可以产生淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、纤维素酶.其中,淀粉酶酶活在发酵2 d时达到最大值163.327 5 U/m L;蛋白酶酶活在发酵3 d时达到最大值92.249 8 U/m L;酯化酶酶活在发酵7 d时达到最大值16.672 5 U/m L.红曲霉ZL307可以产生3种纤维素酶,即内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶,酶活在发酵8 d时达到最大值,其中,滤纸酶活可以达到0.132 2 U/m L,内切酶酶活可以达到0.333 1 U/m L,外切酶活酶活可以达到0.134 7 U/m L,β-葡萄糖苷酶酶活可以达到0.153 8 U/m L.4种酶对温度的耐受性为纤维素酶＞淀粉酶＞蛋白酶＞酯化酶.4种酶对p H的耐受性为纤维素酶＞蛋白酶＞淀粉酶＞酯化酶.

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Preliminary study on multi enzyme properties of Monascus in agricultural products fermentation process

JIANG Wen,TANG Wen-jing,ZHENG Tian-zhu,TAN Sheng,ZHANG Qing-qing∗
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Agricultural and sideline products as rice flour,bran,bean dregs were used as the main nutrient medium with the strain of Monascus ZL307.The conditions had been optimized by orthogonal experimental design.The results showed that amylase activity peaked at 163.327 5 U/m L in 2 days.Protease activity peaked at 92.249 8 U/m L in 3 days.Esterifying enzyme activity peaked at 16.672 5 U/m L in 7 days.Filter paper activity peaked at 0.132 2 U/m L,endonuclease activty peaked at 0.333 1 U/m L,exonuclease activity peaked at 0.134 7 U/m L andβ-glucosidase activity peaked at 0.153 8 U/m L in 8 days.Tolerance to temperature of four enzymes were cellulase＞amylase＞proteinase＞esterase.Tolerance to p H were cellulase＞protease＞amylase＞esterase.

Monascus;liquid fermentation;multi-enzyme properties;orthogonal optimization

Q93.33

A

1672-2477(2015)05-0001-07

2015-08-31

国家大学生创新创业训练计划基金资助项目(201310363021)

蒋 汶(1991-),男,安徽潜山人,硕士研究生.

张庆庆(1954-),女,安徽怀宁人,教授,硕导.

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