湖北省部分地区规模化蛋鸡场H5N1 Re-6亚型禽流感疫苗免疫效果调查

汪招雄，杨玉莹，欧阳金旭，杨丰利，江 涛，陈雪娇

（1. 长江大学动物科学学院，荆州434023；2. 湖北省荆州市畜牧兽医局，荆州434020）

·研究论文·

湖北省部分地区规模化蛋鸡场H5N1 Re-6亚型禽流感疫苗免疫效果调查

汪招雄1，杨玉莹1，欧阳金旭2，杨丰利1，江 涛1，陈雪娇1

（1. 长江大学动物科学学院，荆州434023；2. 湖北省荆州市畜牧兽医局，荆州434020）

禽流感（avian infl uenza，AI）是由A型流感病毒（Avian infl uenza virus，AIV）感染禽类引起的一种从呼吸系统到全身严重败血症等多种症状的高度接触性传染病。目前，对我国家禽产业危害最大的高致病性禽流感病毒是H5禽流感病毒，几乎所有的规模化蛋鸡场都进行了H5禽流感疫苗的预防接种。为了解湖北省规模化蛋鸡场H5N1 Re-6亚型疫苗免疫后抗体滴度，本研究于2014年1～12月期间在湖北省13个地区选择不同规模化蛋鸡场，随机采集2079份蛋鸡血样，用血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）实验检测了H5N1 Re-6亚型禽流感抗体，并对测定结果进行了统计与分析。结果显示，规模化蛋鸡场H5N1 Re-6亚型抗体滴度在6 log2以上的样品数占89.2%，能够保护鸡群抵抗同型病毒的感染。但H5N1 Re-6亚型禽流感抗体滴度整体不高，且仍有少量地区H5N1 Re-6亚型禽流感免疫合格率为60%～80%，提示部分鸡群一旦感染该型病毒，仍然存在发病的危险。

禽流感病毒；H5N1 Re-6亚型；规模化蛋鸡场；免疫效果

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染家禽后引起的多种症状的高度接触性传染病。近些年来，高致病性禽流感疫情已呈全球蔓延之势，呈现出发生频率加快，暴发次数增多，宿主范围扩大，危害更为严重的特点。H5N1高致病性禽流感的暴发，给家禽养殖业可造成毁灭性的打击。病毒毒力较强时鸡群可表现严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高［1，2］。易感动物包括鸡、火鸡、鸭、鹅、野生水禽等动物。H5N1 AIV也可感染人类，甚至导致患者死亡，对公共卫生安全造成极大威胁［3］。世界动物卫生组织（WHO）将禽流感归纳为A类传染病，我国将其定义为一类传染病。

我国将H5N1高致病性禽流感列为强制免疫的疫病之一，采取疫苗免疫和扑杀相结合的综合策略，收到了比较好的防控效果［1，4］。近年来，流行的高致病性禽流感病毒在不断的发生变异，疫苗的选择根据流行毒株的变化需要进行不断的调整。2014年湖北省蛋鸡群中流行的H5N1亚型禽流感毒株主要为2.3.2分支，市场上流通的疫苗也相应的调整为H5N1 Re-6和Re-7二价灭活疫苗［5-9］。然而，由于防疫意识不高，免疫程序不合理，该疾病在部分蛋鸡场仍然时有发生。疫苗免疫抗体监测是了解疫苗免疫效果的有效方法，及时对疫苗免疫效果进行检测尤为必要［10］。本研究从湖北省不同地区随机采集不同日龄蛋鸡样本，监测H5N1 Re-6亚型禽流感疫苗免疫效果，以期制定符合当地鸡群防控H5N1亚型Re-6株禽流感免疫程序，从而对预防H5N1禽流感的发生和流行产生十分重要的生产指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料 禽流感病毒 H5N1 Re-6亚型血凝抑制试验标准抗原（生产批号：201305）；阳性血清购自中国哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 血液采集及血清制备 对湖北省蛋鸡养殖密集区域不同地区（安陆市、公安县、荆门市、潜江市、石首市、松滋市、天门市、浠水县、仙桃市、襄阳市、孝感市、应城市、枣阳市）规模蛋鸡场随机采集血样2079份。静置1 h后离心5 min，取上层血清待检。

1.2.2 1%红细胞悬液制备 用一次性注射器采取健康非免疫公鸡血液，放入加有抗凝剂的离心管中，抗凝剂与全血的比例约为1∶2，迅速混匀。然后离心5 min，吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，加入生理盐水，慢慢混合均匀，离心5 min，弃去上清液，按照上述方法反复操作4～5次，制备红细胞泥。配置1%红细胞悬液。

1.2.3 抗原配制 取出冻干的浓缩抗原，加入2 mL生理盐水稀释融化后，测其抗原效价。能够完全引起血凝的病毒最高稀释度即为抗原效价，以此稀释度作为1个HA单位抗原，配制4个HA单位抗原。

1.2.4 待检样品测定 根据血凝抑制试验操作规范对血清样品进行检测，设置阴性和阳性对照［10］。

1.2.5 结果判定 在红细胞对照出现完全沉淀，病毒对照出现完全凝集的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数作为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清HI效价≥6log2时，判为合格；当被检血清HI效价≥9log2时，判为优秀。

2 结果

2.1 不同月份样本H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价按照不同月份，对2014年1～12月蛋鸡血清共2079份进行抗体分析，结果见表1和表2。

1～12月的HI抗体滴度平均值为8.14 1og2，达到合格水平。5月和7月H5N1 Re-6亚型禽流感平均抗体滴度最高，均为9.26 1og2，1月平均抗体滴度最低，为6.49 1og2。1月和12月样本平均抗体效价均偏低，且与其他月份免疫合格率有很大差距。3月开始平均抗体效价开始升高，5月和7月达到最高，9～12月的平均抗体滴度逐渐降低（表1）。

所有检测样本的H5N1 Re-6亚型禽流感病毒抗体的总合格率为89.2%，总优秀率为49.5%。其中合格率最低的是1月，为67.3%。抗体滴度最高的是7、9、10月，均为100.0%，10月以后逐渐降低。优秀率最低的是12月，为13.4%，最高的是7月，为80.0%。其中1月和12月的优秀率要明显低于其他几个月（表2）。

表1 规模化蛋鸡场不同月份 H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价Table 1 The antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV in diff erent month from large scale layer farm

表2 规模化蛋鸡场不同月份 H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 2 The qualifi ed rate and excellent rate of antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV in diff erent month from large scale layer farm

2.2 不同地区蛋鸡场样本H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价分析 湖北省13个地区样本中，抗体滴度平均值最低的样本来源于应城市，H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价平均为4.65 1og2；抗体滴度最高的样本来源于安陆市，H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价平均为8.82 1og2。除了应城市和松滋市的蛋鸡样本外，其他各个地区的H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价平均滴度值均在7.00 log2 以上（表3）。

表3 不同地区规模化蛋鸡场 H5N1 Re-6 亚型禽流感抗体效价Table 3 The antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent area

各个地区采集来的血液样本中，来源于应城市血样中H5N1 Re-6亚型禽流感抗体合格率最低，为15.0%，其次为公安县，合格率为77.4%，其他地区合格率均在80.0%以上。来源于安陆市、潜江市、石首市、浠水县的血样合格率均为100.0%。来源于应城市和松滋市的血样的优秀率最低，为0.0%和6.7%，浠水县的血样优秀率最高，为70.0%，安陆市、潜江市、枣阳市的样本中 H5N1 Re-6 禽流感抗体优秀率均高于60.0%（表4）。

2.3 不同日龄蛋鸡场样本H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价分析 不同日龄蛋鸡血液样本中，日龄小于等于120的样本H5N1 Re-6亚型禽流感平均抗体滴度值最低，为7.44log2，随着日龄的不断上长，样本中H5N1 Re-6亚型禽流感平均抗体滴度值在120日龄到200日龄之间达到最高值，为8.83 log2（表5）。

不同日龄蛋鸡样本的H5N1 Re-6亚型禽流感抗体合格率均在80.0%以上，蛋鸡日龄在120到200之间的合格率最高，为94.9%；蛋鸡≥120日龄时，H5N1 Re-6亚型禽流感抗体优秀率最低，为37.0%，明显低于其他日龄蛋鸡的血液样本。不同日龄蛋鸡中，H5N1 Re-6亚型禽流感抗体滴度≥9log2的低于70.0%（表6）。

3 讨论

2014年对湖北省13个地区（县、市）规模化蛋鸡场鸡群H5N1 Re-6亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫抗体水平进行了检测，结果显示，在不同月份、不同区域和蛋鸡不同日龄，整体上H5N1 Re-6亚型禽流感抗体滴度较高，高水平维持时间较长，基本可以保护蛋鸡群免受同型病毒的感染。免疫效果与合理的免疫程序、合适的接种剂量以及对疫苗的正确选择有着必不可分的联系［12］。

表4 规模化蛋鸡场不同地区 H5N1 Re-6亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 4 The qualifi ed rate and excellent rate of antibody titer to H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent area

表5 不同日龄蛋鸡 H5N1 Re-6 亚型禽流感抗体效价Table 5 The antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent layer farms

禽流感冬季与春季多发，相较于其他几个月检测样本，1月和12月样本平均抗体效价均偏低，且与其他几个月免疫合格率有很大差距，这可能与冬季来临有关。一方面天气寒冷引起鸡体产生较强的应激反应，影响疫苗免疫效果，另一方面寒冷季节造成部分养殖企业减低疫苗密度，延长H5N1 Re-6亚型禽流感疫苗免疫时间。冬季禽流感多发，鸡群会面临更大威胁，因此养殖企业要在冬季做好保温措施，尽量降低蛋鸡群机体的免疫应激反应，加强日常管理，注意通风与保暖，并根据实际情况加强免疫，保证鸡群对H5N1 Re-6亚型禽流感的合理免疫密度。2～7月的平均抗体效价和合格率、优秀率都呈逐渐增高的趋势，并且在7月达到最高值，这与天气逐渐变暖前高免疫密度有关。8月的平均抗体效价、合格率优秀率降低，这可能与夏季气温升高，鸡群应激反应强和免疫力降低导致鸡群产生抗体能力下降有关。9月的平均抗体效价、合格率优秀率明显高于8月，显示鸡场明显加强了疫苗的免疫。9～12月平均抗体效价、合格率优秀率逐渐降低，这可能与气温逐渐降低，鸡群免疫力减弱有关。

表6 不同日龄蛋鸡 H5N1 Re-6 亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 6 The qualifi ed and excellent rate of antibody titer against H5N1 Re-6 subtype AIV from diff erent layer farms

在不同地区，蛋鸡群H5N1 Re-6亚型禽流感疫苗免疫效果存在一定的差异，导致该现象的原因可能与各地的免疫程序和选择的疫苗有很大的关系。由于各个地方蛋鸡场养殖习惯不一样，养殖水平存在一定的差异，免疫程序、免疫途径、免疫剂量和所免疫的疫苗也存在差异，因此建议养殖者根据最近几年病原流行的变化调整免疫程序，及时进行抗体监测，提高这些地区鸡群H5N1 Re-6亚型禽流感抗体水平［12］。

免疫接种是预防H5N1 Re-6亚型禽流感的最有效方法之一。为了切实防止H5N1 Re-6亚型禽流感的发生，还必须采取科学的方法进行预防，比如在日常管理中认真做好卫生消毒等全方位的安全防护措施等。另外在禽流感疫苗的免疫接种过程中一定要注意注射部位、深度、剂量和卫生标准，这样才能保证确实的免疫效果。

［1］ 田国彬. 禽流感防治技术［M］. 哈尔滨∶ 黑龙江科学技术出版社， 2008∶ 1-145.

［2］ 兰玲， 操礼军， 王涛. 高致病性禽流感流行病学研究进展［J］. 新疆畜牧业， 2007， （5）∶ 14-16.

［3］ 张秀美， 黄艳艳， 胡北侠. 关注禽流感病毒的变异及其公共卫生学意义［J］. 山东畜牧兽医， 2008， 29， （7）∶ 1-4.

［4］ 范月明， 陆艳， 张东华， 等. 高致病性禽流感的综合防控措施［J］. 中国兽医杂志， 2013， 49（7）∶ 91-93.

［5］ Ahmed S S， Themudo G E， Christensen J P， et al. Molecular epidemiology of circulating highly pathogenic avian influenza （H5N1） virus in chickens， in Bangladesh，2007-2010［J］. Vaccine， 2012， 30（51）∶ 7381-7390.

［6］ 孙洪磊， 刘金华. H5N1亚型禽流感病毒的流行与致病性［J］. 生命科学， 2015， 5（27）∶ 525-526.

［7］ 李晶梅， 薛霜. 我国禽流感疫苗的应用概况［J］. 中国家禽，2012， 34（24）∶ 42-44.

［8］ Bi Y， Zhang Z， Liu W， et al. Highly pathogenic Avian influenza A（H5N1） virus struck migratory birds in China in 2015［J］. Sci Rep， 2015， 5∶ 12986.

［9］ 王家敏. 禽流感疫苗研究进展［J］. 山西农业科学， 2012，40（2）∶ 181-185.

［10］ 闻志丹. 规模化养鸡场禽流感疫苗免疫效果检测与分析［D］.杨凌∶ 西北农林科技大学， 2011.

［11］ 帅刚， 张贵云. 禽流感血凝抑制试验的影响因素分析［J］.中国畜禽种业， 2012， 8（4）∶ 124-125.

［12］ 王建华. 禽流感的疫苗免疫及失败原因分析［J］. 养殖技术顾问， 2012， （1）∶ 197-198.

INVESTIGATION INTO FIELD EFFICACY OF H5N1 RE-6 AVIAN INFLUENZA VIRUS VACCINE ON LAYER FARMS IN HUBEI

WANG Zhao-xiong1， YANG Yu-ying1， OUYANG Jin-xu2， YANG Feng-li1， JIANG Tao1， CHEN Xue-jiao1
（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434023， China； 2. Animal Husbandry Bureau of Jingzhou City， Heibei Province Jingzhou 434020， China）

Avian infl uenza is a highly contagious disease causing seriously systemic sepsis. At present， the most devastating agent for poultry industry in China is the H5 subtype Avian infl uenza virus （AIV）. Accordingly， almost all the laying hens of large-scale layer farms have been inoculated with H5 subtype AIV vaccine. In order to understand the fi eld eff i cacy of the H5N1 Re-6 subtype avian infl uenza vaccine， 2079 serum samples were randomly collected in 2014 from large-scale layer farms in thirteen regions of Hubei province to evaluate antibody levels in hemagglutination inhibition （HI） test. The H5N1 Re-6 subtype antibody titers were more than 6 log2 in 89.2% tested samples， which was believed to protect chickens against infection. However， the test results also showed that the antibody titers induced by Re-6 H5N1 subtype AIV were not high so that the risks of AIV infection remains in the regions with low antibody levels.

Avian infl uenza virus； H5N1 Re-6 subtype； large-scale layer farm； immune eff ect

S852.659.3

A

1674-6422（2015）06-0021-06

2015-11-17

长江大学校基金

汪招雄，男，博士，讲师，主要从事动物病毒致病机制研究

汪招雄，E-mail：luke751751@163.com