天津市奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

马腾宇，陈丽丽，汪 志，白娜仁吐雅

（1. 天津食品集团有限公司，天津 300074；2. 天津市奶牛发展中心，天津 300384；3. 天津嘉立荷畜牧有限公司，天津 300402）

·研究论文·

天津市奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

马腾宇1，陈丽丽2，汪 志3，白娜仁吐雅3

（1. 天津食品集团有限公司，天津 300074；2. 天津市奶牛发展中心，天津 300384；3. 天津嘉立荷畜牧有限公司，天津 300402）

通过血平板培养特性、革兰氏染色、生化鉴定试验对天津市由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎进行分离鉴定，并对其进行耐药性分析。结果显示，采集199份奶样中共检出葡萄球菌53株，其中金黄色葡萄球菌40株、表皮葡萄球菌13株；检出的葡萄球菌对头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。因此，可以采用以上4种抗生素对由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎进行治疗。

奶牛；乳房炎；葡萄球菌；药敏试验

奶牛乳房炎与子宫炎、蹄病为奶牛三大难治愈的疾病，是奶牛的一种常见疾病与多发病。乳房炎是乳腺受到病原体的侵袭及物理、化学、微生物刺激所发生的一种炎症变化，是奶牛的一种多发病，也是给奶牛业造成损失最大的疾病之一［1］。奶牛乳房炎由多种病原微生物引起，包括细菌、霉形体、真菌和病毒等，一般以细菌感染为主，其中葡萄球菌是牛乳房炎的最主要病原菌，链球菌和大肠杆菌也比较常见［2-4］。

据统计，全世界每年因奶牛患乳房炎导致的产奶量下降可达380万吨［5］。因此对奶牛乳房炎采取适当治疗和对症用药，减少产奶量损失，对国际奶业的发展具有重要意义。奶牛乳房炎一般采用抗生素治疗，杀灭侵入组织的致病菌，并消除炎症反应。常用抗菌药物有青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、磺胺类及喹诺酮类药等［6］。本研究对天津市引起奶牛乳房炎的葡萄球菌进行分离、鉴定，并进行药敏试验，为指导临床科学用药，有效降低乳房炎的发病率，促进奶牛业的健康持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 奶样采集 在天津市的大港区（位于天津的南部）、静海区（位于天津的西部）、宝坻区（位于天津的北部）不同规模奶牛场选取患乳房炎病牛，其中在大港区3个牛场中选取20头，静海区2个牛场中选取10头，宝坻区4个牛场中选取20头。9个牛场采集199份奶样，其中大港区80份奶样、静海区38份奶样、宝坻区81份奶样。奶样品的采集：先用温水清洗乳房，擦干后用浸有消毒药液（如0.2%新洁尔灭溶液）的湿毛巾擦拭乳房，待皮肤干燥后再以75%酒精棉消毒乳头口及其周围。清洗消毒后，每个乳头挤出3把奶弃掉，以排除一些污染的杂菌，然后以无菌操作的方法，每个乳室分开，1个乳室现挤5～10 mL乳汁装入灭菌试管或无菌小瓶内，封好盖，标上牛号、乳室、日期等，保存于放有冰块的保温箱中，24 h内检验。

1.1.2 试验药品 血琼脂平板：对天津嘉立荷畜牧业有限公司提供的绵羊进行颈部静脉采血，无菌分离血液中的纤维蛋白，再以5%的比例溶于50℃～60℃的营养琼脂中，冷却后置4℃冰箱备用，用于分离培养葡萄球菌。却甫曼琼脂培养基：内含7.5%NaCl（抑制葡萄球菌以外的其它菌生长），用于选择分离葡萄球菌。营养肉汤用于增菌培养。丁胺卡那霉素、红霉素、环丙沙星、青霉素、庆大霉素、氟哌酸、链霉素、恩诺沙星、四环素、氨苄西林、头孢噻肟、克林霉素、复方新诺明12种新药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离培养 将采取的乳样置于无菌离心管中，442～1008×g离心10 min，弃去上层液体，无菌吸取底部沉淀物1 mL，加入含5 mL营养肉汤的玻璃管中，置于摇床上，进行增菌培养24 h。然后挑菌在却甫曼琼脂培养基上进行划线，37℃培养12～24 h后，挑取典型单个菌落接种到绵羊鲜血琼脂平板上再次培养12～24 h，观察细菌生长情况，并进行革兰氏染色，配合显微镜检查，观察细菌形态、革兰氏染色特点，挑选出单个菌落接种到却甫曼琼脂培养基上进行纯培养。

1.2.2 细菌生化鉴定 纯化培养后的细菌进行触酶试验、溶血试验、凝固酶试验、麦芽糖发酵、甘露醇以及七叶苷水解试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》［7］进行鉴定。

1.2.3 药敏试验 在良好的光线下，以有黑字的白纸为背景，将培养液（菌悬液）与硫酸钡标准管进行比浊，调整浑浊度至硫酸钡标准管相同浓度，如细菌浓度过高，用灭菌生理盐水稀释培养液。将溶化好的M-H琼脂倾注直径90 mm的平皿，制成厚3～4 mm的M-H琼脂平板。用灭菌棉拭子蘸取上述浓度的菌悬液，在管内壁将多余菌液挤去，在琼脂平板表面涂布接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周，使菌液均匀涂满整个琼脂平板表面，盖好平皿，室温下干燥5 mim，待平板表面稍干即可放置药敏片。用灭菌镊子以无菌操作，夹住药敏片边缘取出，紧贴在涂有细菌的平板培养基表面。贴药敏片时要轻轻按压，以保证与培养基密切接触。将平皿置于35℃～37℃温箱中培养12～24 h，观察结果。

2 结果

2.1 葡萄球菌的分离与鉴定 葡萄球菌在普通营养肉汤中迅速生长，一致浑浊，浑浊率高，管底部有沉淀。在血平板上生长良好，呈圆形或椭圆形，多成簇，也有成对和单个者，菌落直径约1.5～2 mm，有的菌落呈米黄或金黄色，有的菌落呈乳白或灰白色，均不透明，表面光滑，边缘整齐（图1）。在却甫曼琼脂培养基上生长初期基本与血液琼脂平板相同，3 d后，葡萄球菌呈圆形、黄玉米色、边缘整齐的小菌落，如图2。纯化后的细菌革兰氏染色后镜检显阳性，呈圆形，以单个或短链状、葡萄串状排列（图3）。性，七叶苷水解试验阴性判断为金黄色葡萄球菌。触酶试验呈阳性，γ溶血，凝固酶阴性，麦芽糖阴性，甘露醇阴性，七叶苷水解试验阴性判断为表皮葡萄球菌。

表1 葡萄球菌生化鉴定结果Table 1 Biochemical identifi cation of Staphylococcus

图1 葡萄球菌在血琼脂平板上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Staphylococcus on blood agar

图2 葡萄球菌在却甫曼琼脂培养基上的菌落特征Fig .2 Colony characteristics of Staphylococcus on But FuMan medium

图3 葡萄球菌纯培养物涂片革兰氏染色阳性Fig3 Gram stain result of Staphylococcus

2.2 葡萄球菌和生化鉴定 如表1所示，触酶试验呈阳性，β溶血，凝固酶阳性，麦芽糖阳性，甘露醇阳

2.3 天津市葡萄球菌检出率 天津市3个区9个奶牛场199份奶样中共检出葡萄球菌53株，其中金黄色葡萄球菌40株，表皮葡萄球菌13株，见表2。

表2 奶样中葡萄球菌检出率Table 2 Positive rate of Staphylococcus in milk samples

2.4 药敏试验 对分离鉴定出的2种葡萄球菌进行药敏试验，从表3可以看出，头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素、氟哌酸、四环素对葡萄球菌均有高抑制性；氨卞西林、庆大霉素、克林霉素和复方新诺明对葡萄球菌有抑制作用；青霉素、链霉素以及红霉素对葡萄球菌基本耐药。

3 讨论

马保臣等［8］报道泌乳期临床型乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌为主。周庆国等［9］报道佛山地区4个奶牛场中的奶牛临床型乳房炎主要由链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌感染而引起。本次调查采集199份奶样中，共检出葡萄球菌53株。从引起奶牛乳房炎病原菌的检出率来说，金黄色葡萄球菌检出率为20.10%，表皮葡萄球菌检出率为6.53%，与上述文献调查结果基本相符。张中文等［10］报道北京部分地区临床型乳房炎葡萄球菌占23.81%。殷波等［11］报道四川省某奶牛场临床型乳房炎的病原菌检出率中金黄色葡萄球菌23.3%、表皮葡萄球菌3.3%。袁永隆等［12］报道临床型乳房炎中葡萄球菌占17.14%。可见，不同地区引起奶牛乳房炎的葡萄球菌的检出率仅存在细微差别。

表3 葡萄球菌药敏试验结果Table 3 Results of drug sensitivity test of Staphylococcus

结果显示，引起天津市奶牛乳房炎的葡萄球菌对头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，因此为有效控制此葡萄球菌引起的奶牛乳房炎，可首选以上4种抗生素药物。本研究结果与王登辉等［13］报道的乳样中分离出的金黄色葡萄球菌对头孢和环丙沙星敏感相一致，与马晓艳等［14］研究金黄色葡萄球菌对环丙沙星、恩诺沙星高度敏感显示也相吻合，但李飞等［15］研究表明金黄色葡萄球菌对复方新诺明耐药率却在80%以上。

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IDENTIFICATION AND DRUG SENSITIVITY TESTING OF STAPHYLOCOCCUS STRAINS OF COW MASTITIS IN TIANJIN

MA Teng-yu1， CHEN Li-li2， WANG Zhi3， BAINAREN Tu-ya3
（1. Tianjin Food Group Company Limited， Tianjin 300074， China； 2 Tianjin Dairy Development Center， Tianjin 300384， China；3. Tianjin Jialihe Animal Husbandry Company Limited， Tianjin 300402， China）

The objective of this experiment was to perform isolation， identification and drug sensitivity analysis of Staphylococcus strains from cow mastitis. The Staphylococcus strains were recognized through blood agar cultivation characteristics， gram staining and biochemical identification test. Total 53 Staphylococcus strains were obtained from 199 milk samples， including 40 strains of Staphylococcus aureus and 13 strains Staphylococcus of Epidermis . All of these Staphylococcus strains were signifi cantly sensitive to Cefotaxime， Ciprofl oxacin， Enrofl oxacin and Amikacin， which might be used to treat cow mastitis.

Cow； mastitis； Staphylococcus； drug sensitivity test

S852.61

A

1674-6422（2015）06-0063-05

2015-09-15

马腾宇，男，硕士，兽医师，主要从事奶牛疫病检测

陈丽丽，E-mail：chenLiLi0609@163.com