华南虎狮弓蛔虫三种线粒体基因的遗传进化分析

宋美冉，李康信，石先利，胡 伟，谭立娉，罗 琴，林丽琴，路鹏云，陈 武，李国清

（1. 华南农业大学兽医学院，广州510642；2. 广州动物园兽医院，广州 510075）

·研究论文·

华南虎狮弓蛔虫三种线粒体基因的遗传进化分析

宋美冉1，2，李康信1，石先利1，胡 伟1，谭立娉1，罗 琴1，林丽琴1，路鹏云1，陈 武2，李国清1

（1. 华南农业大学兽医学院，广州510642；2. 广州动物园兽医院，广州 510075）

为研究华南虎狮弓蛔虫（Toxascaris leonina）线粒体基因的分子特性，对来源于4只华南虎的狮弓蛔虫的pcox1、pnad1和pnad4三种线粒体基因进行了扩增、克隆和测序，采用DNAStar和MEGA5.05软件对所获序列，以及GenBank中公布的狮弓蛔虫等相关序列进行了同源性比对和遗传进化分析。结果显示，4只华南虎的狮弓蛔虫扩增的pcox1、pnad1、pnad4基因序列长度分别为393、366、399 bp，3段基因序列种内变异明显低于种间变异。系统进化树中，狮弓蛔虫可分为猫科和犬科动物两大分支，其中4只华南虎的狮弓蛔虫与已报道的孟加拉虎、东北虎、华南虎、非洲狮、猞猁的狮弓蛔虫聚为一支；另外狼和犬的狮弓蛔虫聚为一支；以pnad1、pnad4建立的系统发育树中，虎源狮弓蛔虫又单独聚为一支，表明狮弓蛔虫在不同虎类之间并没有严格的宿主特异性。该研究为狮弓蛔虫的分子鉴定和分子遗传学研究提供了科学依据。

狮弓蛔虫；华南虎；线粒体基因；遗传进化

狮弓蛔虫（Toxascaris leonina）是珍稀野生哺乳动物尤其是猫科、犬科动物（如狮、虎、豹、狐等）的一种常见寄生虫，属于线形动物门（Nematoda）、尾感器纲（Phasmidia）、蛔目（Ascaridida）、蛔科（Ascaridae）、弓蛔属（Toxascaris）。狮弓蛔虫感染可以影响虎的营养代谢，造成生长发育迟缓，甚至死亡［1］。其幼虫还可感染人，特别是兽医、工作人员及游客［2］，属于人兽共患寄生虫。线粒体DNA（mitochondria DNA，mtDNA）是真核细胞的核外环状遗传物质，其特点是结构简单，母系遗传，极少发生重组，进化速度快［3］。mtDNA在种间、种内都具有广泛的多态性，可作为研究种群遗传多样性的良好分子标记［4］。由于线粒体基因具有较高的突变率，在同一基因组内各基因之间突变率不同，使得这些基因在寄生性蠕虫分子分类学和群体遗传学研究中成为有用的遗传标记，特别是对那些隐藏种，线粒体基因比rDNA基因显得更为有效［5，6］。近年来国内外学者对犬猫及部分野生动物狮弓蛔虫的细胞色素c氧化酶亚基I（cox1）、烟酰胺脱氢酶亚基I（nad1）、烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ（nad4）基因进行了扩增与遗传进化分析［7，8］。本研究通过扩增广州某动物园华南虎狮弓蛔虫的部分线粒体基因（pcox1、pnad1、pnad4），结合GenBank上公布的其他地区不同动物的狮弓蛔虫线粒体基因，分析狮弓蛔虫线粒体基因的遗传进化关系，为进一步开展狮弓蛔虫的分子鉴定和分子遗传学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 虫体样品和主要试剂 蛔虫样品（T1、T2、T3、T4）分别采自广州市某动物园的4只华南虎的粪便，虫体洗涤后，置于75%酒精中-20℃保存。DNA提取试剂盒WizardTMDNA Clean Up System购自Promega公司；ExTaq酶、DL-2000 DNA Marker、pMD18-T 载体、top10感受态细胞、IPTG和X-gal购自TaKaRa公司；蛋白酶K、DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 虫体DNA的提取 4条虫体各剪取一小段，用灭菌双蒸水冲洗3次，剪碎，加入275 μL 10%SDS DNA裂解液，混匀后放入恒温箱中，55℃消化过夜。将消化好的虫体悬液按WizardTMDNA Clean Up System试剂盒使用说明提取虫体DNA。

1.3 ITS序列的PCR扩增 参照王培园等［9］设计的引物扩增ITS序列，上游引物为5'-GTAGGTG AACCTGCGGAAGGATCATT-3'，下游引物为5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCG CT-3'，预计扩增长度为1000 bp，上述引物由英维捷基（上海）贸易有限公司合成。扩增体系：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）3.0 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL、上下游引物（25 μmol/mL）各1.0 μL、模板DNA 1 μL、EX Taq酶（5U/μL）0.25 μL，ddH2O加至25 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 pcox1、pnad1、pnad4基因的PCR扩增 参照Gasser等［10］设计的引物JB3（5'-TTTTTTGGGCAT CCTGAGGTTTAT-3'） 和JB4.5（5'-TAAAGAAAG AACATAATGAAAATG-3'）扩增pcox1基因，预期扩增片段大小约450 bp。参照李明伟等［11］设计的引物扩增pnad1和pnad4基因，pnad1上游引物为 5'-TTCTTATGAGATTGCTTTT-3'，下游引物为 5'-TATCATAACGAAAACGAGG-3'，预期扩增片段大小约370 bp；pnad4上游引物为 5'-TTATTATTTAATTTTTTAT-3'，下游引物为 5'-ATATGA GTAACAGAAGAATAAGC-3'，预期扩增片段大小约400 bp。上述引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。以提取的虫体DNA为模板，利用相应引物扩增pcox1、p n a d1、p n a d4基因片段，扩增体系均为：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）4.0 μL（pcox1、pnad4）/3.0 μL（pnad1）、dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL、上下游引物（25 μmol/ mL）各1.0 μL、模板DNA 1 μL、ExTaq酶（5U/μL）0.25 μL，ddH2O加至25 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃（cox1、nad1）/44℃（nad4）退火30 s，72℃（cox1、nad1）/68℃（nad4）延伸30 s，共35个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR产物的纯化、克隆与测序 利用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，并与pMD18-T载体连接，转入Top10感受态细胞，再涂布到含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB平板上，无菌挑选白色单菌落，进行菌液PCR鉴定，筛选阳性克隆。将阳性克隆的菌液送到北京华大生物技术有限公司测序。

1.6 序列比对与遗传进化分析 在GenBank中下载有关线虫的pcox1、pnad1及pnad4基因序列，采用DNAStar中MegAlign软件比较华南虎狮弓蛔虫与其他线虫pcox1、pnad1及pnad4基因序列的同源性；采用MEGA5.05软件分析不同序列间的碱基组成与变异位点，并用该软件以最大似然法（maximum likelihood，ML）绘制种系发育树。

2 结果

2.1 狮弓蛔虫的分子鉴定 4个样品的ITS序列长度：T1为907 bp，T2为902 bp，T3为908 bp，T4为904 bp，与预期长度相符。将4个样品的序列与GenBank公布的相关蛔虫ITS序列进行比对，结果显示该4个序列与狮弓蛔虫（JF837175.1）的相似性最高，达99.6%以上，证实4个样品均为狮弓蛔虫。

2.2 pcox1、pnad1、pnad4基因的扩增结果 4只华南虎狮弓蛔虫扩增的pcox1、pnad1、pnad4基因片段分别为450、370、400 bp，与预期大小相符，且无非特异性条带（图1）。

2.3 pcox1基因序列分析 4个样本pcox1片段长度均为441 bp，剔除引物后，得到393 bp的序列，其中A、T、C、G碱基含量分别为18.3%～18.6%、47.8%～48.3%、9.2%～9.7%、23.9%～24.2%。序列比对结果显示（图2），4个样品之间pcox1相似率为98.7%～99.7%，与已报道的猫科动物东北虎、非洲狮、孟加拉虎、华南虎、猞猁的狮弓蛔虫（登录号分别为：JF780947.1、JF780948.1、JF780949.1、JF780950.1、JF780951.1）相似率为97.2%～100%，与犬科动物狼、犬狮弓蛔虫（登录号：JF780946.1、KC293930.1、KC293933.1、AJ920063.1、AJ920064.1）的相似率为92.6%～94.1%，与蛔科其他线虫（登录号：KC543477.1、EU628682.1、AB591803.1、KC172104.1、AB591800.1）相似率为90.3%～92.6%，与蛔目其他线虫（登录号：AJ616898.1、JF780943.1、AJ920062.1）的相似率为89.1%～90.6%。

图1 狮弓蛔虫pcox1（A）、pnad1（B）、pnad4（C）基因片段的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplifi cation result of pcox1 （A）， pnad1 （B）and pnad4 （C） gene of Toxascaris leonina

2.4 pnad1基因序列分析 4个样本pnad1片段长度均为368 bp（包含上下游引物），A、T、C、G碱基含量分别为15.0%～15.3%、53.3%～53.6%、8.2%～8.5%、23.0%～23.2%。序列比对结果显示，4个样本pnad1之间的相似率为98.9%～99.7%，与已报道的猫科动物东北虎、孟加拉虎、华南虎、非洲狮、猞猁狮弓蛔虫（登录号分别为：JF833961.1、JF833963.1、JF833964.1、JF833962.1、JF833965.1）相似率为97.0%～100%，与犬科动物狼、犬狮弓蛔虫（登录号：KC293954.1、AJ937267.1、KC293967.1、JF833960.1）的相似率为91.0%～92.6%，与浣熊拜林蛔虫（Baylisascaris procyonis，JF951366.1）的相似率为90.7%，与犬弓首蛔虫（Toxocara canis，KC293923.1）和猫弓首蛔虫（T. cati，JF833957.1）相似率为84.2%～86.6%，与诺曼副丝虫（Parafilaroides normani，KJ801815.1）和疑似栓尾线虫（Passalurus ambiguous，KF472130.1）的相似率分别为70.8%和72.7%（图3）。

图2 华南虎狮弓蛔虫与部分其他蛔虫pcox1序列的同源性比对Fig.2 The homological comparison of pcox1 gene between T. leonina from the South China Tiger and partial other roundworms

2.5 pnad4基因序列分析 4个样本pnad4片段长度均为402 bp（含上下游引物），其中A、T、C、G碱基含量分别为17.0%～17.3%、49.4%～49.9%、12.0%～12.5%、20.8%～21.1%。序列比对结果显示（图4），4个样本pnad4之间的相似率为99.0%～100%，与已报道的猫科动物东北虎、孟加拉虎、华南虎、非洲狮、猞猁的狮弓蛔虫（登录号分别为：JF833972.1、JF833974.1、JF833975.1、JF833973.1、JF833976.1）相似率为96.2%～100%，与来自狼、犬的狮弓蛔虫（登录号：JF833971.1，AJ937630.1）相似率为89.2%～90.5%，与弓首科犬弓首蛔虫（AJ937618.1）、猫弓首蛔虫（AJ937624.1）的相似率为82.7%～84.0%，与蛔目其他线虫（登录号：F J 4 2 6 2 3 6.1、A Y 9 0 9 4 6 5.1、K J 7 2 4 4 8 4.1）相似率为77.1%～79.8%。

2.6 系统进化分析 基于pcox1、pnad1、pnad4基因序列以ML法建立的系统进化树基本一致（图5），狮弓蛔虫可分为两大分支，其中4条华南虎狮弓蛔虫（T1、T2、T3、T4）与已报道的孟加拉虎、东北虎、华南虎、非洲狮、猞猁的狮弓蛔虫聚为一支（▲标记），形成一个寄生于猫科动物的分支；另外狼和犬的狮弓蛔虫聚为一支（◆标记），形成一个寄生于犬科动物的分支；而以pnad1、pnad4建立的系统发育树中，虎源狮弓蛔虫则单独聚为一支（★标记）。

图3 华南虎狮弓蛔虫与部分其他蛔虫pnad1序列的同源性比对Fig.3 The homological comparison of pnad1 genes between T. leonine from the South China tiger and partial other roundworms

图4 华南虎狮弓蛔虫与部分其他蛔虫pnad4序列的同源性比对Fig.4 The homological comparison of pnad4 genes between T. leonina from the South China Tiger and partial other roundworms

3 讨论

图5 狮弓蛔虫pcox1 （A）、pnad1（B）、pnad4 （C）基因以ML法建立的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on pcox1 （A）， pnad1 （B）， pnad4 （C） gene of T. leonina by maximum likelihood （ML） method

mtDNA在种间、种内均具有广泛的多态性。Feagin等［12］研究表明cox1基因序列中度保守且碱基替换率较高，可作为优良的分子标记。陈志港等［7］研究证实nad1是NADH氧化还原酶的第一个亚基，可从种的水平来推断某个属的系统发育关系。而Brown等［13］和Liu等［14］的研究表明nad4变异适中，含有准确的系统发育信息，是系统进化和种群遗传研究中理想的分子标记。本研究选取上述3段线粒体基因对广州市某动物园华南虎狮弓蛔虫的遗传变异情况进行了研究，结果发现3段基因在碱基组成上均存在偏倚，其中A+T含量均明显高于G+C含量，这与李明伟等［11］关于线粒体遗传密码组成偏好A、T的报道一致。4只华南虎狮弓蛔虫（T1、T2、T3、T4）3段线粒体基因的变异率均在0%～1.3%，与已报道的狮弓蛔虫线粒体基因相比，其种内差异明显小于与其他蛔虫的种间差异。猫科、犬科动物狮弓蛔虫3段基因的变异率大小依次为nad4＞nad1＞cox1，这与Li等［8］的研究结果一致，支持了nad4基因变异最大，nad1基因次之，cox1基因变异最小的观点。研究还发现，4个样品3段基因与文献报道的猫科动物狮弓蛔虫的变异率明显小于它们与文献报道的犬科动物狮弓蛔虫的变异率。进化树分析表明，猫科动物与犬科动物的狮弓蛔虫分属于两个不同的进化分支。从pnad1、pnad4角度考察，4个样品与虎源狮弓蛔虫的变异率均小于与猫科其他动物狮弓蛔虫的变异率，而pcox1并没有表现此特征。基于pnad1、pnad4基因构建的系统发育进化树中，虎源狮弓蛔虫与狮子、猞猁的狮弓蛔虫明显分开，这在一定程度上反映线粒体基因nad4和nad1进化较快，比cox1基因更适合用于寄生虫系统发生的研究，这与Blouin［15］对20种线虫的cox1和nad4基因序列的分析以及Gasser等［10］对9种带科绦虫的cox1、nad1基因序列分析结果一致。

此外，本研究比较了广州市某动物园华南虎狮弓蛔虫与文献报道的其他虎源狮弓蛔虫（均来自四川省某动物园）3段线粒体基因的遗传差异，发现广州动物园华南虎狮弓蛔虫间的3段基因变异率与四川动物园华南虎和其他虎狮弓蛔虫相应基因变异率没有明显的区别，可能是狮弓蛔虫在不同虎类之间并没有严格的宿主特异性。本研究结果为狮弓蛔虫的分子鉴定和分子遗传学研究提供了科学依据，对野生动物保护具有一定的指导意义。

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PHYLOGENETIC ANALYSIS OF THREE MITOCHONDRIAL GENES OF TOXASCARIS LEONINA FROM SOUTH CHINA TIGER

SONG Mei-ran1，2， LI Kang-xin1， SHI Xian-li1， HU Wei1， TAN Li-ping1， LUO Qin1， LIN Li-qin1，LU Peng-yun1， CHEN Wu2， LI Guo-qing1
（1. College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China； 2. Veterinary Hospital of Guangzhou Zoo， Guangzhou 510075， China）

In order to study the molecular characteristics of mitochondrial gene of Toxascaris leonina from South China tigers， three mitochondrial genes， pcox1， pnad1 and pnad4 were amplifi ed， cloned and sequenced. The sequence similarities and genetic evolutional relationship among T. leonina strains were analyzed by the DNAStar and MEGA version 5.05 software. The results showed that the sequence lengths of pcox1， pnad1 and pnad4 genes of four samples were 393 bp， 366 bp and 399 bp， respectively， and their intra-specifi c diff erences were signifi cantly lower than inter-specifi c diff erences. The phylogenetic trees based on the three genes demonstrated that the T. leonina were divided into two groups， one comprising isolates from feline， the other comprising those from canine. In phylogenetic trees based on pnad1 and pnad4， all the T. leonina isolates from tigers located in same small clade. These results indicated that there might be no host specifi city between T. leonina from diff erent tigers. The present study highlighted the research of molecular identifi cation and genetic characterization of T. leonina.

Toxascaris leonina； South China tiger； mitochondrial genes； phylogenetic analysis

S852.65

A

1674-6422（2015）06-0068-08

2015-07-16

国家自然科学基金项目（31272551）

宋美冉，女，硕士，主要从事兽医寄生虫研究

李国清，E-mail：ggLi@scau.edu.cn；陈武，E-mail：guangzhouchenwu@sina.com