对虾白斑综合征病毒液相芯片快速检测方法的建立

任 硕，陈政晓，王 政，王 艳

（1. 上海出入境检验检疫局，上海 200135；2. 上海大学，上海 200444；3. 上海市浦东新区农产品安全检测中心，上海 201202）

·研究论文·

对虾白斑综合征病毒液相芯片快速检测方法的建立

任 硕1，陈政晓2，王 政3，王 艳1

（1. 上海出入境检验检疫局，上海 200135；2. 上海大学，上海 200444；3. 上海市浦东新区农产品安全检测中心，上海 201202）

本研究通过设计、合成并修饰基因特异性引物和寡核苷酸探针并标记生物素，利用该探针与荧光编码微球偶联后，与抽提的对虾白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WWSV）的PCR产物进行杂交反应，用液相芯片检测仪（Luminex200）检测荧光信号建立了WWSV快速液相芯片检测方法。该方法具有较好的特异性，偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应，而不与其他虾病病毒基因反应，可以检测到107的稀释度。本研究初步建立的WSSV液相芯片检测方法为进一步建立几种虾病同时快速检测奠定了基础。

对虾白斑综合征病毒；液相芯片；快速检测

对虾养殖是我国海水养殖的支柱产业，但近年来，病害的频发严重制约了其发展。其中，对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV），是全球对虾养殖业危害最大的病原体［1，2］。该病毒传染力强、致死率高，在十多年的时间里给全球对虾养殖业造成了巨大的损失。WSS是国际兽疫局必须上报的疫病，也是我国农业部规定的二类动物疫病。因此建立一种快速特异有效的检测方法尤为迫切，这样可以从源头上严防WSSV随进境水产品进入我国，对保护我国的对虾养殖业具有重要意义。液相芯片技术，又称悬浮阵列/流式荧光技术，具有高通量、敏感性高、速度快的特点［3-6］，既可进行免疫学检测也可进行核酸检测。本研究利用液相芯片技术对WSSV进行检测，并评价该方法的灵敏度和特异性，以期为多种虾病的快速检测、诊断提供一种敏感、快速和高效的方法。

1 材料和方法

1.1 质粒和样品 WSSV及其他对照质粒：黄头病毒（Yellow head virus，YHV）、桃拉病毒（Taura syndrome virus，TSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，IHHNV）、流行性溃疡综合征病毒（Epizootic ulcerative syndrome virus，EUS）、流行性造血器官坏死病病毒（Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV）、锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）由上海出入境检验检疫局食品中心动毒室构建和保存。所有样品均为进境鲜活水产品草虾样品。

1.2 试剂和仪器 链霉素-亲和素-藻红蛋白（SAPE）购自美国Invitrogen公司；表面羧基化的荧光编码微球购自美国Bio-Rad公司；Luminex 200液相芯片检测仪为美国Luminex公司产品。

1.3 探针及引物的设计和合成 根据GenBank登录的WSSV基因序列（登录号：AY249435.1），应用DNAStar软件找出基因中最保守的25个寡核苷酸（oligo nucleotide，nt）作为液相芯片检测探针，探针的Tm值尽量保持在56℃～58℃，分别在探针的上下游设计特异性的扩增引物，应用Primer Premier 5.0软件设计引物。引物、探针送Invitrogen公司合成，下游引物的5'端标记生物素，Probe的5'-C6标记氨基，探针反向互补序列RC-Probe的5'端标记生物素。P1：5'-ACGTGTTGGAAGAAGCGTCGTCG-3'；P2：5'-TGCTGCACACGTCAATGAGGG-3'；探针：5'-AGAGAGGTCCTACAATACTC-3'。引物用水溶解成200 pmol/μL贮存母液备用。

1.4 寡核苷酸探针与微球的共价偶联 将所有试剂恢复至室温，重悬微球，取200 μL微球（5×106）至1.5 mL的聚丙烯微量离心管中，离心去上清，加入MES（0.1 mol/L，pH=4.5）50 μL混匀，加入相应的寡核苷酸探针0.2 nmol/mL。加入新鲜配制的EDC溶液（10 mg/mL）10 μL，充分混匀，室温避光孵育30 min，重复1次。用1 mL Tween-20（0.02 %V/V）和1 mL SDS（0.1% w/v）各洗涤1次，最后用适量的MES（0.1mol/L，pH=4.5）重悬微球，采用血球计数法对制备的荧光编码微球进行计数，计算出荧光编码微球的浓度，2℃～8℃避光保存。

1.5 PCR扩增体系的建立 用QIAamp DNA Blood Mini Kit抽提带有WSSV的基因质粒，通过聚合酶反应对WSSV进行扩增。PCR反应体系总体积20 μL：约200 ng的模板DNA、800 mol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+、每条引物5 pmol/μL、1.5 U Taq酶。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，72℃再延伸5 min。反应结束后，取5 μL PCR产物在1.5 %的琼脂糖凝胶上行电泳检测。

1.6 微球偶联 反应体系包括22 μL寡核苷酸探针偶联微球的微球杂交液及3 μL PCR产物。将杂交检测混合物混匀，95℃变性5 min，46℃杂交45 min；加入75 μL SA-PE，混匀后置于46℃孵育15 min，在Luminex 200多功能流式点阵分析仪上进行读数分析。

1.7 阈值的确定 以伯乐公司Luminex液相芯片检测系统对杂交产物进行检测，通过检测仪直接读取实验中偶联特异性探针的微球，重复3次。阳性判断值（cut-off）的确定，取20份阴性样品，采用液相芯片进行检测，计算每种特异性检测微球平均荧光强度（median fluorescent intensity，MFI）的均数（x）和标准差（s），以x+3s所得的值作为对应检测指标的cut-off值，高于cut-off值就视为阳性。

1.8 液相芯片检测方法灵敏度试验 将WSSV质粒DNA作梯度稀释：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，作为PCR扩增模板，用PCR体系进行扩增后，采用建立的液相芯片检测体系进行检测，确定所建立方法的灵敏度。

1.9 液相芯片检测方法特异性试验 以本实验室保存的YHV、TSV、WSSV、IHHNV、EUS、EHNV、KHV的质粒作为PCR扩增模板，用PCR体系进行扩增后于建立的液相芯片检测体系中进行检测。

2 结果

2.1 PCR检测方法的建立及检测结果 在反应体系中其他条件相同的情况下，确定的PCR最佳引物终浓度分别为0.1 pmol/μL、0.05 pmol/μL，镁离子浓度为2.5 mmol/L，以此条件建立了WSSV PCR检测方法。将WSSV质粒抽提DNA进行PCR检测，可特异性地扩增出目的条带，与理论结果相符（图1）。

图1 WSSV PCR检测结果Fig.1 PCR result for WSSV

图2 液相芯片检测体系灵敏度Table 2 The sensitivity test of liquichip for WSSV

2.2 液相芯片检测体系阈值的确定 提取其他方法确定的WSSV阴性样品20份的DNA，经PCR扩增后，用于液相芯片的检测。20份阴性样品的MFI分别为：86、94、79、13.5、44、45、40、14、0、12、28.5、4、2.5、5、45、0、22、10、23、25.5，通过计算得到MFI为29.650，s为28.673，其阈值为29.650+3*28.673=95.669

2.3 液相芯片检测体系灵敏度 将WSSV质粒DNA作梯度稀释，作为模板用PCR扩增后，采用建立的液相芯片检测体系进行检测。结果显示，MFI值与稀释度的log值存在线性关系，即MFI=-134.8logx+1140，其中x表示稀释度，R2=0.969（图2）。因此可以根据MFI对病毒的污染量做半定量分析，灵敏度高达107倍稀释度，约合12.6 copies。

2.4 液相芯片检测体系特异性 用建立的液相芯片检测法对其他相关病毒质粒进行检测，结果如图3所示。WSSV的MFI值为1152，其余样品的MFI值均低于cut-off值，呈阴性，说明该方法特异性良好。

图3 液相芯片检测体系特异性Table 3 The specifi city test of liquichip for WSSV

3 讨论

1987年和1988年，我国台湾地区发生养殖对虾大规模死亡的事件，这是世界范围首次出现的所谓“虾瘟”（对虾白斑症）。随后，白斑症传遍亚洲和印度太平洋地区的绝大多数对虾养殖场。1995年10月份，西半球报道了第一例对虾白斑症。虽然自对虾白斑症首次暴发以来，人们一直在寻求防治的方法，但是至今仍未能有效的控制该病毒病的发生与发展。对疑似病例进行早期快速有效的诊断，将十分有助于疫情的控制。

液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的，被誉为后基因组时代的芯片技术，它有机地整合了有色微球、激光技术、高速数字信号处理和计算机技术，具有通量大、灵敏度高、用量少等优点。

寡核苷酸探针杂交的最佳条件就是既能保证杂交的特异性，又能在适当的速率下形成稳定的杂交体。探针序列越长，越易形成杂交体，但缺乏特异性，且杂交速率减慢。短探针具有较高的特异性，但存在不稳定的杂交体缺陷。温度对杂交效果有明显的影响，因此选择最适当的杂家温度可以增强杂交的特异性，降低非特异性杂交的荧光强度。我们在试验中，根据探针的Tm值，选定42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃六个温度梯度为研究对象，考察不同杂交温度下液相芯片的检测效果。结果表明，MFI随着温度的升高平缓上升，但温度达到46℃时，MFI达到最大值，杂交温度达到48℃时，平均荧光强度骤弱，存在显著性差异，故最终选择46℃作为最佳反应温度进行后续实验。

本研究建立了能特异性识别WSSV的液相芯片检测方法，可对WSSV进行快速检测。WSSV液相芯片技术的建立，也为开发多种虾病病毒同时检测的快速高效检测方法提供了参考。

［1］ 邓敏， 何建国， 吕玲， 等. 斑节对虾白斑综合征病毒部分基因组文库及核酸探针检测法［J］. 水产学报， 2000，24（2）∶ 161-166.

［2］ 黄 倢， 宋晓玲， 于佳， 等. 杆状病毒性的皮下及造血组织坏死-对虾爆发性流行病的病原和病理学［J］. 海洋水产研究， 1995， 16（1）∶ 1-10.

［3］ Bay J T， Garred P. Rapid bead-based immunoassay for measurement of mannose-binding lectin［J］. Scand J Immunol， 2009， 69（6）∶ 570-575.

［4］ Arellano-Garcia M E， Hu S， Wang J， et al. Multiplexed immunobead-based assay for detection of oral cancer protein biomarkers in saliva ［J］. Oral Dis， 2008， 14 （8）∶705-712.

［5］ Livingston A D， Campbell C J， Wagner E K， et al. Biochip sensors for the rapid and sensitive detection viral disease［J］. Genome Biol， 2005， 6（6）∶ 112-115.

［6］ Linkov F， Yurkovetsky Z， Lokshin A. Hormones as biomarkers∶ practical guide to utilizing Luminex technologies for biomarker research［J］. Methods Mol Biol， 2009， 520∶ 129-141.

PRELIMINARY DEVELOPMENT OF LIQICHIP DETECTION TECHNIQUE FOR RAPID DETECTION OF WHITE SPOTSYNDROME VIRUS

REN Shuo1， CHEN Zheng-xiao2， WANG Zheng3， WANG Yan1
（1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine， Shanghai 200135， China； 2. Shanghai University， Shanghai 200444， China；3. Agricultural Product Safety Testing Center of Shanghai Pudong New District， Shanghai 201202， China）

Specifi c White spot syndrome virus （WSSV） primers and probe labeled with biotin were designed， synthesized and modifi ed for development of a liquichip detection method. The resulting probe was used for hybridization reaction to PCR products of WSSV， then the detection technique was developed by using Liquichip 200 to screen fl uorescence signal from the reaction system. The results showed that this method was specifi c to WSSV but not to other shrimp viruses. The sensitivity test indicated the detecting limit for WSSV reached to 10-7. Further study need to develop a multiplex liquichip technique for rapid detection of a number of shrimp viruses.

White spot syndrome virus； liquichip； rapid detection

S852.659.5

A

1674-6422（2015）06-0027-04

2015-10-27

上海检验检疫局科技计划项目（HK006-2011）

任硕，男，工程师，主要从事进出境检验检疫工作

王艳，E-mail：wang_yan@shciq.gov.cn