E-钙黏蛋白和VEGF在胃黏膜的表达及其相关性分析

王　锐　宋征宇　于永强　杨婕琳

·论著·

E-钙黏蛋白和VEGF在胃黏膜的表达及其相关性分析

王锐宋征宇于永强杨婕琳

目的通过分析E-cadherin和VEGF在慢性胃炎、肠上皮化生、非典型增生及胃癌中表达变化的趋势，探讨二者在几种胃黏膜病变表达的相关性。方法用免疫组织化学法检测E-cadherin和VEGF在慢性胃炎组、肠上皮化生组、非典型增生及胃癌中的表达情况，胃黏膜非癌组织中的表达分别与胃癌组比较，并分析二者相关性。结果在慢性胃炎、肠上皮化生、非典型增生中VEGF表达的阳性率呈逐渐上升趋势，而E-cadherin的表达逐渐下调，分别与胃癌组作对照分析，表达的差异均有统计学意义（P＜0.05）。相关性比较提示二者表达存在负相关。结论E-cadherin与VEGF的表达呈负相关，二者均参与胃黏膜逐渐演变过程，对于E-cadherin和VEGF表达异常的胃黏膜肠上皮化生或非典型增生患者，两者的联合监测对胃癌癌前病变的诊治有一定的参考意义。

E-钙黏蛋白；血管内皮生长因子；胃肿瘤；癌前病变

肿瘤是危害人类健康的重要疾病，远处转移是恶性肿瘤导致死亡的主要原因之一。很多上皮来源的肿瘤在不同程度上其细胞上皮间转化被不适当的激活或破坏，通过细胞-细胞或细胞-细胞外基质的改变及相互作用，使其易于脱离原发部位，从而具有远处转移的能力。E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达是细胞上皮间转化的重要标志［1］，具有细胞与细胞间相互黏附、维持组织结构完整性和极性的作用。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）可对血管内皮细胞具有强烈的促分裂和趋化作用，同时促进血管内物质渗出，为血管内皮细胞迁移和肿瘤细胞转移提供基质。目前在胃黏膜非癌组织中E-cadherin和VEGF的相关性报道较少，本文旨在探讨胃黏膜不同状态下二者的关系。对肠上皮化生、非典型增生的发生、发展及分子标志物进行初步探索，从而为降低胃癌发病率及早期发现胃癌提供依据。

对象与方法

一、一般资料

选取河北北方学院附属第一医院门诊胃镜室2012年12月至2013年12月行胃镜检查患者220例，男性118例、女性102例，年龄28～81岁（平均年龄60.6岁）。其中慢性胃炎组40例，肠上皮化生组60例，非典型增生组60例，胃癌组60例，且胃癌患者均为首次发现，术前未经过手术、放化疗或免疫治疗等。

二、方法

应用免疫组化进行检测，所采用试剂鼠抗人E-cadherin单克隆抗体、VEGF单克隆抗体，二抗染色试剂盒，枸橼酸抗原修复液、DAB显色液及PBS等均购于北京中杉金桥生物有限公司。经常规脱蜡、修复、过氧化氢（H2O2）封闭后滴加一抗，VEGF（1：100），E-cadherin（1：50），4℃过夜，滴加二抗试剂37℃孵育15 min，最后DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。

三、结果判断

所有指标的结果均由两位有经验的病理医师经双盲法判定。E-cadherin主要位于细胞膜和（或）细胞浆，VEGF主要位于细胞浆，免疫组化阳性反应为黄-棕褐色颗粒。阳性细胞数计算方法为：每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计100个细胞中的阳性细胞数，取均值，以百分数表示细胞阳性指数。染色强度：无染色为0分；浅黄色为1分；黄色为2分；棕黄或棕褐色为3分。阳性细胞百分率：无阳性细胞为0分，阳性细胞数＜25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度与阳性细胞百分率之和：0分为（-），1～2分为（＋），3～4分为（＋＋），5～7分为（＋＋＋）。

四、统计学处理

分析所有数据应用SPSS 19.0统计软件，计数资料组间率的比较用采用χ2检验。相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0.05有统计学差异。

结果

一、E-cadherin和VEGF在几种不同胃黏膜病理状态中的表达（见表1）

表1　E-cadherin和VEGF在胃黏膜不同病理状态的表达变化

E-cadherin在慢性胃炎、肠上皮化生、非典型增生、胃癌组中表达呈逐渐下调，阳性率分别为82.5%、61.7%、51.7%、21.7%。与胃癌作对照比较有统计学意义，P＜0.05（见图1）。慢性胃炎、肠上皮化生、非典型增生、胃癌组中VEGF表达随着病变发展呈上升趋势，阳性率分别为7.5%、65.0%、73.3%、88.3%。与胃癌作对照比较亦有统计学意义，P＜0.05（见图2）。

二、E-cadherin和VEGF在癌前病变和胃癌中的表达

分别将肠上皮化生、非典型增生、胃癌组中E-cadherin和VEGF表达情况进行相关性分析，在三组中二者表达均呈负相关，见表2。

表2　E-cadherin和VEGF表达的相关性

讨论

内皮细胞形成一个选择性的半透膜，控制血管和组织之间的细胞信号双向传送。这个功能需要通过上皮型钙粘蛋白（E-cadherin）调节内皮细胞-细胞连接的动态平衡来完成。E-cadherin是一类介导细胞与细胞间相互黏附、具有维持组织结构完整性和极性的钙依赖性跨膜糖蛋白。E-cadherin表达缺失可导致细胞黏附、连接功能障碍，内皮通透性增加。人类的多种疾病及疾病的病理状态都不同程度上出现了通透性的改变，而引起了生物医学领域研究者的高度兴趣。研究发现敲除E-cadherin基因的小鼠，在3个月后出现胃黏膜系细胞增生，12个月后出现印戒样细胞，其在形态学上类似印戒细胞癌；24个月或更久，未发生侵袭性胃腺癌，因此认为E-钙黏蛋白的丧失可能导致癌前期病变的胃黏膜，但不足以供其恶性转化［2］。另一项研究表明［3］敲除E-cadherin和p53基因的免疫缺陷小鼠，出现了低分化腺癌和印戒细胞癌，间充质标记上皮间质转化相关基因的高表达。目前研究表明E-cadherin表达缺失与胃癌的发生发展相关。进一步的研究证实与胃癌的TNM分期、分化程度，侵袭性、淋巴结转移的因素有密切关系，表达下调时往往提示预后不良［4］。我们研究提示：E-cadherin在胃黏膜慢性炎症、肠上皮化生、非典型增生、胃癌中表达逐渐减少。同时Zullo A等［5］研究发现肠上皮化生的发生与E-cadherin表达下调相关。说明在胃黏膜癌前状态中E-cadherin出现一定程度的表达异常。

图1　E-cadherin免疫组化结果

图2　VEGF免疫组化结果

血管内皮生长因子（VEGF），为单一基因编码的同源二聚体糖蛋白，能直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分裂，并增加微血管通透性。介导新生血管形成并诱导蛋白溶解酶的生成降解细胞外基质。它是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝分裂原。李建波等［6］研究将癌前病变与胃癌组织中VEGF表达比较分析提示其差异有统计学意义。成旭惠等［7］发现VEGF与胃癌的浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关。我们在研究中发现：慢性胃炎中VEGF阳性细胞仅少量表达，但是随着细胞病变程度的增加，VEGF表达有一定的上升趋势，阳性率分别为7.5%、65.0%、73.3%、88.3%，与胃癌作对照比较P＜0.05有统计学意义。可见VEGF参与了胃黏膜演变的过程。

为了探讨E-cadherin和VEGF在胃黏膜表达的作用，本实验将二者进行相关性分析，结果显示，二者在胃黏膜中的表达具有负相关性，说明二者可能存在负性反馈调节作用。E-cadherin在胃黏膜慢性炎症、肠上皮化生、非典型增生、胃癌中表达逐渐减少，而VEGF的表达呈逐渐上调趋势。来源于有关E-cadherin和VEGF蛋白表达及调节通路的研究可支持以上结果。C armeliet等［8］发现敲除VE-钙黏蛋白基因对小鼠胚胎有致死性的作用，表现出严重的血管发育缺陷，主要是缘于影响了内皮细胞凋亡和VEGF（血管内皮生长因子）信号表达。另一项研究表明［9］，E-cadherin的功能与VEGF-R2（血管内皮生长因子受体2，也被称为的Flk1）有密切相关。E-cadherin在静止的内皮细胞上有调节VEGFR2的抗凋亡作用。在血管生成的信号传导途径中内皮细胞的可塑性，如细胞出芽，迁移，渗透性，均受E-钙黏蛋白和VEGF-R2相互作用的调节。E-cadherin基因的表达下调是由多种因素影响而导致的，这些因素包括Snail、Slug、TGF-β、Twist等转录调控因子，其中转录抑制因子蛋白质TWIST是一种潜在的促进细胞增殖，抑制细胞凋亡致癌基因，可促进血管内皮生长因子（VEGF）的合成，参与肿瘤进展和转移［10］。此外，E-cadherin的缺失或减少是影响肿瘤上皮细胞间质样转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的最重要因素之一，从而使得肿瘤细胞从原发灶中分离。E-cadherin是介导细胞间及细胞与细胞外基质黏附的主要分子，在维持上皮细胞间连接、控制细胞极性、分化及组织形态的发生等方面起重要作用［11］。E-cadherin减少或缺失后，胃癌细胞间的黏附力减弱，易使癌细胞弥漫生长，不能形成腺管，容易脱落及向远处转移。E-cadherin的下调又可以激活β-连蛋白通路，引起VEGF基因表达增加［12］。VEGFR和Wnt通路调节EMT在胰腺、乳腺、结肠等多种实体瘤中表达。

因胃黏膜癌前病变发展成为癌症的时间不确定，而且多数患者无特异性症状，目前对于胃黏膜肠上皮化生及非典型增生的监测，主要是内镜、病理等，如将组织或血液中分子标志物用于联合监测，将对临床有重要的意义。本文结果显示，E-cadherin表达下降和（或）VEGF表达上调可参与胃黏膜逐步演变的过程，目前实验结果提示E-cadherin和VEGF表达异常尚不能作为诊断标致物，但可作为肠上皮化生及非典型增生的患者监测和随访的参考，对于有E-cadherin和VEGF表达异常的患者加强检测和随访，联合检测其表达程度，可粗略判断癌前病变的状态，对胃癌的预防、早期发现，有一定的参考意义。

如何制定科学合理的监测随访方案，甚至对不同危险因素的患者制定个体化，提高成本-效益比是临床诊疗中的目标。对于有E-cadherin和（或）VEGF表达异常的肠上皮化生及非典型增生的患者，发生胃癌的概率，预后的因素，目前尚无报道，深入研究胃黏膜肠上皮化生和非典型增生的发生、发展及预后的关系，可能为我们逆转癌前病变及分子标志物监测有一定的临床参考价值。

1Liu X，Chu KM.E-cadherin and gastric cancer：cause，consequence，and applications.Biomed Res Int，2014，2014：637308.doi： 10.1155/2014/637308.

2Mimata A，Fukamachi H，Eishi Y，et al.Loss of E-cadherin in mouse gastric epithelial cells induces signet ring-like cells，a possible precursor lesion of diffuse gastric cancer.Cancer Sci，2011，102（5）：942-950.

3Shimada S，Mimata A，Sekine M，et al.Synergistic tumour suppressor activity of E-cadherin and p53 in a conditional mouse model for metastatic diffuse-type gastric cancer.Gut，2012，61（3）：344-353.

4Xing X，Tang YB，Yuan G，et al.The prognostic value of E-cadherin in gastric cancer：a meta-analysis.Int J Cancer，2013，132（11）：2589-2596.

5Zullo A，Romiti A，Borrini F，et al.Alteration of E-cadherin expression in gastric mucosa：role of intestinal metaplasia and Helicobacter pylori infection.Anticancer Res，2004，24（3a）：1603-1607.

6李建波，李新民，詹惟.胃癌及癌前病变组织中VEGF和iNOS蛋白的表达.细胞与分子免疫学杂志，2011，27（5）：561-562.

7成旭惠，欧希龙，宋永谦.COX-2及VEGF在胃癌中的表达及临床意义.江苏医药，2012，38（17）：2034-2036.

8Carmeliet P，Lampugnani MG，Moons L，et al.Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis.Cell，1999，98（2）：147-157.

9Gavard J.Gavard J.Endothelial permeability and VE-cadherin：a wacky comradeship.Cell Adh Migr，2013，7（6）：455-461.

10 Wallerand H，Robert G，Pasticier G，et al.The epithelial-mesenchymal transition-inducing factor TWIST is an attractive target in advanced and/ormetastatic bladder and prostate cancers.Urol Oncol，2010，28（5）：473-479.

11 Smith A，Teknos TN，Pan Q.Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma.Oral Oncol，2013，49（4）：287-292.

12田立立，王艳丽，黄韧.肿瘤转移中E-钙黏蛋白的调控.中国实验动物学报，2012，20（3）：81-85.

Correlation between E-cadherin and VEGF expression of the gastric mucosa

WANG Rui，SONG Zheng-yu，YU Yong-qiang，YANG Jie-lin.

First Affiliated Hospital of Hebei North University，075000，China

Objective To explore the correlation between E-cadherin and VEGF by analyzing the expression of E-cadherin and VEGF in chronic gastritis，intestinal metaplasia，atypical hyperplasia，and gastric cancer.Methods The expression of E-cadherin and VEGF was detected in chronic gastritis，intestinal metaplasia，atypical hyperplasia and gastric cancer by immunohistochemistry，so that to investigate the difference and correlation between E-cadherin and VEGF in gastric non-cancerous tissues compared with gastric cancer. Results Compared with gastric cancer group，the positive expression of VEGF was gradually increased in chronic gastritis，intestinal metaplasia，and atypical hyperplasia，while the expression of E-cadherin showed a significant reduction（P＜0.05）.The expression of E-cadherin and VEGF was negatively correlated.Conclusions E-cadherin and VEGF expression was negatively correlated，which both involved in the progression of gastric mucosa.Therefore，combined monitoring the expression of E-cadherin and VEGF might play a significant value for diagnosing precancerous lesions of gastric cancer.

E-cadherin；VEGF；Gastric carcinoma；Precancerous lesions

2014-11-21）

（本文编辑：何美蓉）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.001

075000河北北方学院附属第一医院