不同浓度5⁃氨基酮戊酸对光动力方法抗白念珠菌效果的影响

徐辉　陈虹霞　邹先彪（．解放军医学院，北京00853；．解放军总医院第一附属医院皮肤科，北京00048）

不同浓度5⁃氨基酮戊酸对光动力方法抗白念珠菌效果的影响

徐辉1陈虹霞2邹先彪2
（1．解放军医学院，北京100853；2．解放军总医院第一附属医院皮肤科，北京100048）

目的通过测定白念珠菌内不同光敏剂浓度下生成原卟啉IX（PpIX）的水平及5⁃氨基酮戊酸光动力疗法（5⁃ALA⁃PDT）对白念珠菌的抑菌率，为临床选择最佳光敏剂浓度提供理论依据。方法制备白念珠菌悬液，与ALA避光孵育，采用激光共聚焦显微镜观察PpIX产生情况，MTT法测定5⁃ALA⁃PDT对白念珠菌生长的抑制率。结果白念珠菌与ALA避光孵育后有荧光物质PpIX产生，ALA光敏剂浓度与PpIX强度呈正相关，当ALA浓度到达300 mg／mL时，PpIX强度将不再增加。对照组无荧光物质出现。结论ALA⁃PDT对白念珠菌抑制效应同光敏剂浓度密切相关。这为临床ALA⁃PDT治疗白念珠菌疾病提供了理论依据。

5⁃氨基酮戊酸；光动力；白念珠菌；药物浓度

［Chin J Mycol，2015，10（2）：104⁃107］

念珠菌作为人体常见的条件致病菌，常引起局部及全身系统的感染，近年来随唑类抗真菌药的广泛应用，其耐药性不断增强，这使得人们不断寻求新的治疗手段和方案。5⁃ALA⁃PDT是近年来兴起的一种治疗皮肤病的光化学技术，被证明可以杀死细菌、酵母和丝状真菌等微生物［1］。在抑制芽管和生物膜形成、降低念珠菌对口腔上皮细胞黏附性方面效果明显［2］。由于各国的研究者所使用的ALA的浓度、激光光源、孵育时间、总能量都有所不同，导致对ALA⁃PDT的疗效评价缺乏一致性［3］。本研究通过测定白念珠菌与5⁃ALA不同浓度下生成PpIX的水平及5⁃ALA⁃PDT抑菌率，探求PpIX峰值出现的规律，为5⁃ALA⁃PDT治疗局部念珠菌感染选择最佳光敏剂浓度提供理论依据。现将研究结果报道如下。

1　材料和方法

1．1菌株与试剂

试验用白念珠菌标准菌株5株（编号sc5314）取自304医院皮肤科实验室。5⁃ALA：由上海复旦张江生物医药股份有限公司提供，临用前以生理盐水配制成ALA溶液。PBS缓冲液、HyClone改良型RPMI1640液体培养基、沙堡氏培养基由Gibico公司提供。MTT购自武汉亦新生物技术有限责任公司。二甲基亚砜（DMSO）购自西陇化工股份有限公司。

1．2主要仪器

LD600⁃A型半导体激光治疗机，波长为635 nm，最大输出功率密度为100 mw／cm2，由武汉亚格光电技术有限公司提供。RT⁃3000全自动洗板机，DNM⁃9602酶标分析仪（由北京普朗新技术有限公司生产），空气浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司制造）；TCSSPII型激光共聚焦显微镜（德国Leica公司产品）；倒置显微镜（奥林帕斯，日本）。

1．3方法

白念珠菌悬液的制备将白念珠菌在新鲜配制的沙堡氏培养基上连续转种两次，35℃培养24 h后，取生长良好的菌落5个加入放有50mL YPD液体培养基的150mL锥形瓶中，置于37℃恒温摇床摇动培养（100 r／min）24 h获得菌液，用1640培养液稀释。通过血细胞计数板调整含菌量，使菌悬液含菌量为1×106CFU／mL。接种时加人96孔细胞培养板，每孔100μL。

白念珠菌的分组试验组：6组，分别加入终浓度为50 mg／mL（5%）、100 mg／mL（10%）、200 mg／mL（20%）、300 mg／mL（30%）、400 mg／mL（40%）、500 mg／mL（50%）ALA溶液，避光35℃孵育60min，每组6个培养孔，3个用于测定PpIX，以平均值计算胞内PpⅨ水平；3个用于测定光动力处理后的MTT测定。设3个对照组：a：白念珠菌菌悬液组，不进行光动力处理；b：菌悬液加不同浓度ALA不进行照光组；c：菌悬液不加ALA只进行光照处理组。对照组35℃孵育60min。

半导体激光照射激光头与培养板的垂直距离为2 cm，刚好能覆盖培养孔上口，照射的能量密度为27 J／cm2。照光时间3min。

激光共聚焦显微镜观察PpIX荧光产生情况

将不同浓度的混悬培养物滴加在准备好的干净的载玻片，盖上盖玻片，吸水纸吸除周边液体，直接放置在激光共聚焦荧光显微镜观察，用随机自带软件进行荧光强度定量分析。

菌落计数光照后，立即将各组菌悬液用PBS进行倍比稀释，使菌悬液含菌量为1×104CFU／mL，分别取样100μL转到另一张无菌培养板上，35℃避光培养24 h后进行菌落计数。

MTT法测定不同光敏剂浓度下ALA⁃PDT对白念珠菌活力的抑制率光动力处理结束后，每孔加入20μL MTT（5 mg／mL），100μL PBS培养4 h。终止培养后小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL DMSO，37℃温箱孵育10min。之后用酶标仪检测OD 490 nm各孔的吸光度（A）值。计算白念珠菌细胞活力＝（试验组A值⁃调零孔A值）／（对照孔A值⁃调零孔A值）×100%，从而得出抑制率。

1．4统计学分析

2　结　果

2．1定量分析

表1　不同浓度5⁃ALA与白念珠菌避光35℃共孵育60min后PpIX荧光强度Tab．1　PpIX fluorescent intensity after C．albicans incubated with dif⁃ferent concentration of ALA

固定孵育时间和照光剂量，对照组没有产生荧光强度，试验组随ALA浓度的升高PpIX生成也增强（见表1）。通过spss统计软件分析F值43．868，P＜0．05，各实验组两两分析：200 mg／mL、300 mg／mL、400 mg／mL、500 mg／mL ALA溶液与白念珠菌避光孵育产生的PpIX荧光强度之间无差异，与50 mg／mL及100 mg／mL浓度相比差异显著。从经济效益角度来看，选择200 mg／mL ALA浓度最为经济有效。

2．2倒置显微镜观察

不同浓度ALA⁃PDT处理后倒置显微镜所见，见图1。

图1　a、b、c、d、e、f分别为50 mg／mL、100 mg／mL、200 mg／mL、300 mg／mL、400 mg／mL、500 mg／mL浓度ALA⁃PDT处理后倒置显微镜下图片Fig．1　Inverted microscope image after 5⁃ALA⁃PDT solution with differ⁃ent concentration of ALA：a．50 mg／mL，b．100 mg／mL，c．200 mg／mL，d．300 mg／mL，e．400 mg／mL，f．500 mg／mL

随浓度升高，首先菌丝和孢子都在不断减少，200 mg／mLALA浓度光动力处理后菌丝和孢子均消失。300 mg／mL ALA浓度以上的光动力处理后既看不到菌丝和孢子，生物膜结构也开始变得松散无章（图片黑色影为生物膜结构）。

2．3MTT法测定ALA⁃PDT对白念珠菌活力的抑制率

随ALA浓度的升高，抑制率增加，浓度大于300 mg／mL时，白念珠菌几乎达到完全抑制（见表2）。统计分析F值为2 017．9，200 mg／mL以上各浓度组与50 mg／mL、100 mg／mL两两比较P＜0．05，差异有统计学意义。意味着从200 mg／mL开始白念珠菌开始被显著抑制。超过300 mg／mL，白念珠菌几乎完全抑制。200 mg／mL以上各组之间P＞0．05无统计学差异。

2．4菌落计数

随ALA浓度增加，白念珠菌菌落数不断减少，超过300 mg／mL，菌落数均为0（见表3）。统计分析数据F值为2 034．34，两两分析显示，对照组各组间P＞0．05，无统计学意义；对照组分别与50 mg／mL组、100 mg／mL组比较P＜0．05，有统计学差异。对照组与200 mg／mL组比较P＜0．01，有显著统计学意义。200 mg／mL以上浓度各组间P＞0．05无统计学差异。

表2　MTT法测定不同ALA浓度下ALA⁃PDT抑制率Tab．2　Used by MTT method to determine the inhibition rate of Candi⁃da albicans after 5⁃ALA⁃PDT solution with different concentration of ALA

表3　不同ALA浓度PDT处理后菌落计数Tab．3　The colony count of Candida albicans after 5⁃ALA⁃PDT solu⁃tion with different concentration of ALA（Mean±SD）

3　讨　论

随着激素、广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛应用，真菌感染的发病率不断上升，真菌耐药性日趋严重，使得抗真菌药物治疗面临的挑战越来越大。5⁃ALA⁃PDT是一种联合应用5⁃ALA及相应光源，通过光动力学反应生成具有杀伤细胞作用的单态氧，选择性破坏病变组织的全新技术。广泛用于治疗光化性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌、鲍恩病等皮肤癌前病变和肿瘤［4⁃6］，其应用前景值得期待［7⁃10］。5⁃ALA作为一种内源性的生化物质经局部酶反应后，最终转化为PpIX。光动力抗菌化学疗法的疗效取决于真菌体内PpIX的生成水平，而PpIX在真菌体内的合成受游离血红素浓度的反馈调节，当外源性ALA过量时，在真菌细胞会产生过量的PpIX，如不发生光动力学反应，PpIX将在体内亚铁螯合酶催化下与铁离子结合生成血红素［11］，从而使PpIX水平下降。本次试验结果显示，随ALA浓度增加，白念珠菌体内的PpIX也在不断增加，在50～300 mg／mL浓度下白念珠菌的抑制率与浓度呈正相关，到300 mg／mL以上白念珠菌完全抑制。这一结果与梁义［12］所做试验相吻合。白念珠菌具有孢子相和菌丝相，苑天红等［13］推测，有效阻止孢子相向菌丝相转变，即可降低白念珠菌对口腔颊黏膜细胞的黏附，进而降低白念珠菌的毒力。从倒置显微镜图片可以看出光动力疗法不光针对白念珠菌的孢子相起作用，对菌丝相同样起到杀伤作用。随ALA浓度增加，白念珠菌菌落数不断减少，200 mg／mL以上各组之间统计学无意义，但与对照组及低浓度组相比较差异有统计学差异。说明200 mg／mL浓度开始，对白念珠菌的抑制作用比较显著。超过300 mg／mL，菌落数均为0。

MTT是测定真核细胞活性的重要工具。其原理是活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原与MTT结合，生成蓝紫色结晶可在酶标仪上读取吸光度值，并以此反映细胞的代谢活性。Levitz等［14］最早使用MTT方法测定真菌细胞的活力，本实验中通过测定吸光度值计算出光动力治疗对白念珠菌生长的抑制率。随ALA浓度的升高，抑制率增加，从200 mg／mL开始白念珠菌开始被显著抑制，浓度大于300 mg／mL时，白念珠菌几乎达到完全抑制。对照组各组白念珠菌几乎无抑制。

4　结　论

本研究采用通过测定白念珠菌内不同光敏剂浓度下生成原卟啉IX（PpIX）的水平，在此基础上进行了5⁃ALA⁃PDT抑菌抑菌效果的试验。本实验从原卟啉IX的产生强度、白念珠菌抑制率、剩余菌落计数几个方面观察了各浓度ALA光动力法对白念珠菌的抑制作用，从实验结果看200mg／mL以上浓度各组白念珠菌开始被显著抑制，考虑经济成本因素，认为200 mg／mL ALA浓度是光动力法抑制白念珠菌的最佳浓度。由于体外培养条件下白念珠菌增殖与体内实际感染情况存在差别，因此，今后我们将采用动物实验进一步研究ALA⁃PDT抗菌效应，为临床治疗局部真菌感染提供更完善的理论依据。

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［本文编辑］卫凤莲

The antifungal effect of 5⁃aminolevulinic acid photodynamic therapyat different concentrations on C．albicans

XU Hui1，CHEN Hong⁃xia2，ZOU Xian⁃biao2
（1．Chinese PLA Medical School，Beijing 100853，China；2．Department of Dernatlogy，First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijng 100048，China）

ObjectiveTo contribute theoretically to the selection of the optimal concentration of the photosensitizer through the determination of the level at which C．albicans generate protoporphyrin IX（PpIX）under different concentrations of the photosensitizer and of the bacteriostatic rate of 5⁃amino ketones pentanoic acid photodynamic therapy（5⁃ALA PDT）．MethodsC．albicans suspen⁃sion was prepared and incubated with ALA in the dark．The generation of PpIX was observed under a laser confocal microscope．The inhibitory rate of 5⁃ALA PDT on C．albicans was determined by MTT method．ResultsAfter dark incubation，C．albicans and ALA produced fluorescent PpIX．ALA concentration was positively correlated with the intensity of PpIX．When drug concentration reached300mmol／L，the intensity of PpIX strength ceased to increase．There was no fluorescent material in control group．Conclusions The inhibitory effect of ALA PDT on C．albicans was closely related to the concentration of the photosensitizer，which provides data for treatment of C．albicans infection．

5⁃amino ketones pentanoic acid；photodynamic；C．albicans；drug concentration

R 379．4

A

1673⁃3827（2015）10⁃0104⁃04

徐辉，男（汉族），硕士研究生在读，主治医师．E⁃mail：81764988＠qq．com

邹先彪，E⁃mail：xbzou＠126．com

2014⁃12⁃30