白假丝酵母菌突变株ORF19．2500的功能研究

牛理达　陈晓庆　赵静　吴建华　郑庆虎（．上海长海医院皮肤科，上海004；．上海大学，上海0046；．解放军5医院皮肤科，郑州45004）

白假丝酵母菌突变株ORF19．2500的功能研究

牛理达1陈晓庆2赵静1吴建华1郑庆虎3
（1．上海长海医院皮肤科，上海200433；2．上海大学，上海200436；3．解放军153医院皮肤科，郑州450042）

目的筛选50株白假丝酵母菌基因缺失菌，寻找出对白假丝酵母菌生物被膜形成相关基因，进一步探究白假丝酵母菌生物膜的致病机制。方法利用培养生物被膜的方法筛选50株基因缺失菌；利用XTT法验证所筛选出的白假丝酵母菌突变株ORF19．2500生物被膜形成缺陷；进一步观察ORF19．2500基因缺失菌生长、菌丝形成。结果用XTT法证明白假丝酵母菌突变株orf19．2500生物膜形成缺陷，且生长曲线和滴琼脂平板的方法均提示其生长速率减慢。在spider培养基上白假丝酵母菌突变株orf19．2500不能诱导菌丝形成，但在YPD＋10%小牛血清则菌丝形成正常。结论白假丝酵母菌突变株orf19．2500可利用spider培养基缺陷而影响其酵母、菌丝二态性的转化，及其生物被膜的形成。

白假丝酵母菌；orf19．2500；酵母；菌丝；生物膜

［Chin J Mycol，2015，10（2）：70⁃74］

近年来，随着免疫缺陷宿主的不断增多，深部真菌感染在临床上大幅上升，已成为免疫功能低下患者死亡的主要原因之一，白假丝酵母菌是人体常见的条件致病菌之一，是深部真菌感染的首要病原菌，占医院内微生物感染的第4位［1］。研究发现，白假丝酵母菌生物被膜的形成使致病力明显增加，尤其一些体内移植物和塑胶制品如义齿、导尿管放置的患者，白假丝酵母菌很容易在其表面形成有孢子、酵母、假菌丝和细胞外基质等构成的三维立体结构，不仅增加真菌的侵袭性，而且使其抗药性明显增加，因此对白假丝酵母菌生物被膜的深入研究成为我们目前了解真菌致病机制和研究抗真菌药物的重点［2］。该实验利用spider培养基和10%小牛血清孵育的方法，可体外诱导生物被膜形成［3］的方法对50株白假丝酵母菌基因缺失株进行筛选，进而发现白假丝酵母菌突变株orf19．2500生物被膜形成缺陷，通过考察其生长、菌丝形成，试图阐明白假丝酵母菌突变株orf19．2500的功能及影响生物被膜形成的分子机制。

1　材料和方法

1．1材料

菌株来源采用白假丝酵母菌标准菌株SN250和50株白假丝酵母菌突变菌株由上海中科院巴斯德所陈昌斌教授馈赠。

主要试剂小牛血清（sigma公司），XTT（Sigama公司），YPD培养基（yeast⁃peptone⁃dex⁃trose medium）、YPD液体培养基、spider培养基及PBS溶液，XTT粉末和甲萘醌粉末根据文献配制和保存。

1．2方法

白假丝酵母菌突变菌株库的筛选将冻存于⁃80℃的菌株解冻于YPD琼脂培养基复苏、分离纯化，挑取单菌落将其转种于YPD液体培养基中，30℃摇床，200r／min，培养过夜；将12孔培养皿（Nest Biotech Co，Ltd）中分别加入1mL 10%的小牛血清（Sigma，corporation），37℃摇床，200r／min，孵育过夜；将处于对数期生长的菌悬液，用spider培养基稀释成菌浓度为1×107cells／mL，在37℃摇床，200r／min，培养90min后（黏附阶段），弃去未黏附的悬浮细胞，用1mL PBS溶液洗1次，加入2mL新鲜的spider培养基，37℃摇床，200r／min，培养48 h，肉眼评估打分筛选出生物膜生长明显受限的白念珠菌突变菌株［3］。

基因敲除菌的验证将冻存于⁃80℃的菌株解冻与YPD琼脂培养基上，选取6个orf19．2500的单菌落，1个SN250的单菌落，挑菌于含有15μL的zymolase的PCR管中，充分混匀，放入PCR仪，调整程序为37℃15min，95℃10min，最终为10℃，而后加入135μL的PCR dd H2O稀释10倍，充分混匀后，取出两排8联PCR管，1～7号加入2μL CBO178＋179的引物，9～14号加入2μL CBO542＋543的引物，7和14号管加入稀释后5μL SN250的底物，8号管加PCR 5μL dd H2O，其余管内加入的是稀释后的5μL orf19．2500的底物，然后每个管内依次加入10×Tag buffer 5μL，2．5 mM dNTP mix 4μL，Tag酶0．5μL，dd H2O 33．5μL，然后充分混匀，放入PCR仪中扩增程序为94℃5min，94℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，72℃10min，最终降为10℃延伸，重复此循环30次，该步骤由Noble SM实验室提供。

XTT法［4］检测白假丝酵母菌突变株orf19．2500对生物膜形成的影响接种处于对数期生长的两种菌，用spider培养基稀释成1×106Cellss／mL，分别取100μL稀释的标准菌SN250加入96孔培养板的A1⁃A5号孔内中，基因缺失株加入A7⁃A12号孔内，B1⁃B5孔加入不含菌液的spider培养基作为对照，37℃摇床，200 rmp／min，培养90min（黏附阶段）后弃去上清液，PBS洗涤3次，再次加100μL spider培养基培养48 h后，弃上清，PBS洗涤3次，每孔加入100μL 0．5 g／L的XTT和1 μmmol／L的甲萘醌溶液，避光37℃，静止培养1 h后用酶标仪测定其在490 nm波长处的A值。将5个独立孔的A值进行平均，利用ANOVA来进行统计学分析，P＜0．05，差别具有统计学意义。

表1　本研究所用基因敲除菌验证的引物及其序列Tab．1　Primers used for verifyication the disruption of target genes

生长情况的测定将过夜培养的白假丝酵母菌标准株SN250，突变株orf19．2500，用YPD液体培养基稀释成菌浓度为2×106cells／mL，1．5 h后测OD600值，而后每2 h测1次OD值，连续12 h绘制出生长曲线［5］，对比他们之间的生长的变化。接种过夜培养的白念珠菌的标准株SN250和突变株，将三种菌的菌悬液分别稀释至100、10⁃1、10⁃2、10⁃3（细胞浓度由1×107cells／mL至1×104cells／mL），接种于YPD琼脂培养基中，培养24 h，对比他们在YPD琼脂培养基中的生长情况。

诱导菌丝形成接种处于对数期生长的两种菌用spider培养基和YPD＋10%小牛血清稀释成菌浓度为1×107cells／mL，取5mL加入试管中，37℃摇床，200 r／min，分别培养2 h、4 h、6 h后，取出10μL加入载玻片，再加盖玻片，光学显微镜观察菌丝诱导情况。

2　结　果

2．1基因缺失株的鉴定

琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示（见图1），目的基因已经成功敲除，白假丝酵母菌突变株orf19．2500构建成功。

2．2利用XTT法证明白假丝酵母菌突变株orf19．2500生物膜形成缺陷

在肉眼条件下，可见到白假丝酵母菌标准菌株SN250形成的生物膜能基本覆盖一个完整的培养皿，而突变株orf19．2500肉眼几乎看不到有培养皿上有生物膜形成（见图2），提示突变株orf19．2500不能很好地利用spider培养基，而使生物膜形成缺陷；同时利用XTT法进一步证实突变株orf19．2500在spider培养基上形成生物膜的能力差，两者比较差别有统计学意义。

2．3白假丝酵母菌突变株orf19．2500的生长缺陷

在YPD培养基上，100、10⁃1、10⁃2、10⁃3不同菌悬液浓度梯度上均可以看出突变株orf19．2500的生长缺陷；同时我们利用YPD液体培养基绘制生长曲线的方法证实了突变株orf19．2500的生长缺陷，白假丝酵母菌标准菌株Y250的倍增时间大概是1．5 h，而突变株orf19．2500倍增时间大概是3．5 h（见图3）。

2．4白假丝酵母菌突变株orf19．2500在spider和YPD＋10%小牛血清培养基上的菌丝形成

在光学显微镜下，可以观察到白假丝酵母菌标准菌株SN250，在spider和YPD＋10%小牛血清上2 h起即有菌丝形成，而随着时间的延长形成菌丝的数量逐渐增加，且长度也在增加；而突变株orf19．2500在spider培养基上一直以酵母相出现，但是在YPD＋10%小牛血清上则是和标准菌株SN250一样始终是以菌丝态存在（见图4）。

3　讨　论

白假丝酵母菌是一种共生的真菌，主要存在于肠道黏膜和泌尿生殖道黏膜表面，对于大部分人来说它是良性存在的，但是当机体的免疫功能和内环境的稳态受到损害，白假丝酵母菌感染就变成可能。大部分白假丝酵母菌感染的产生是由于它具有产生生物膜的能力［6］。生物被膜常常存在于移植物的表面，与感染相伴随，因而具有重要的临床意义。

对白假丝酵母菌生物膜的研究成为抗真菌治疗的关键，我们利用体外培养生物膜的方法对实验室的50个基因的突变株进行筛选，发现ORF19．2500形成生物膜的能力明显下降，利用白念珠菌基因组数据库寻找，发现对该基因的功能研究甚少，仅推测一些区域具有转移酶的活性且与生物合成相关［7］。实验结果中该基因缺失株在spider培养基上生物膜形成缺陷。白假丝酵母菌的生物膜的形成分四个阶段：第一阶段为白假丝酵母菌的黏附阶段，一般发生于黏附初期的90～120min，第二阶段为白假丝酵母菌为增殖和定向出芽生殖阶段，该阶段中白假丝酵母菌形成大量的菌丝和假菌丝；第三阶段为白假丝酵母菌细胞外基质形成阶段，使生物膜形成一个三维立体结构，是白假丝酵母菌生物膜发挥耐药机制的主要阶段；第四个阶段为生物膜的中孢子向外周扩散［8］。基因缺失株ORF19．2500在spider培养基中2 h、4 h、6 h均以酵母态存在，而在YPD＋10%小牛血清中能成功诱导出菌丝，在这四个阶段中白假丝酵母菌定向出芽生殖形成假菌丝和菌丝的阶段是最重要的阶段，研究表明使菌丝形成受限的基因缺失株很难构成完整的生物膜。由图2、4可见，该基因利用spider培养基受限制，不能诱导其正常的出芽生殖从而使其生物膜形成明显缺陷。那么对白假丝酵母菌突变株orf19．2500在spider培养基上诱导生物膜形成时，一些菌丝相关基因如ECE1、HWP1、ALS3、Hyr1及其诱导菌丝形成的信号通路［9］的表达情况是我们下一步研究的重点。

我们利用白假丝酵母菌数据库寻找突变株ORF19．2500基因功能时发现该基因的保守序列与ERG9的保守序列相似，通过寻找白假丝酵母菌中ERG9的功能发现，该基因同样具有spider培养基利用缺陷［10］，同时发现ERG9介导白假丝酵母菌麦角固醇合成途径［11］，因此对该白假丝酵母菌突变菌ORF19．2500的功能可进行进一步探讨。

白假丝酵母菌突变株0RF19．2500除了具有生长缓慢的功能外，在spider培养基上还可明显地利用缺陷进而影响其酵母、菌丝二态性的转化和生物膜的形成，丰富了该未知基因的功能。

致谢：上海中科院巴斯德研究所陈昌斌教授馈赠白假丝酵母菌突变株ORF19．2500。

图1　白假丝酵母菌突变株基因组DNA的PCR验证　图2　a．标准菌株SN250的生物膜，b．突变株orf19．2500的生物膜，c．XTT法比较标准菌株SN250和突变株orf19．2500生物膜形成差异　图3　a．白假丝酵母菌的标准株Y250（a）和突变株orf19．2500，接种于YPD琼脂培养基中，不同浓度梯度的生长情况；b．标准株SN250和突变株orf19．2500的生长曲线　图4　标准株SN250和orf19．2500在液体菌丝诱导培养基中在培养2 h、4 h、6 h的菌丝形成能力Fig．1　PCR analysisi confirming Candida albican mutant orf19．2500　Fig．2　a．The biofilm of wild⁃type Y250，b．The biofilm of mutant orf19．2500，c．XTT analysis of the biofilm in wild⁃type Y250 and mutant orf19．2500　Fig．3　a．The wild⁃type SN250 and mutant orf19．2500 were spotted in 4⁃fold di⁃lutions（from 1×107cells／mL to 1×104cells／mL）onto yeast extract peptone dextrose（YPD）plates；b．Time⁃growth curve of C．albicans wild⁃type SN250 and mutant orf19．2500　Fig．4　C．albicans with wild⁃type SN250 and the mutant orf19．2500 were grown in liquid spider and YPD plus 10% fetal bovine serum media at 37℃for 2 h，4 h，6 h，and then photographed（Bar＝100 μm）

［1］Noble SM，French S，Kohn LA，et al．Systematic screens of a Candida albicans homozygous deletion library decouple morpho⁃genetic switching and pathogenicity［J］．Nat Genet，2010，42（7）：590⁃598．

［2］ten CJM，Klis FM，Pereira⁃Cenci T，et al．Molecular and cellular mechanisms that lead to Candida biofilm formation［J］．J Dent Res，2009，88（2）：105⁃115．

［3］Nobile CJ，Fox EP，Nett JE，et al．A recently evolved transcrip⁃tional network controls biofilm development in Candida albicans［J］．Cell，2012，148（1⁃2）：126⁃138．

［4］Li DD，Zhao LX，Mylonakis E，et al．In vitro and in vivo activities of pterostilbene against Candida albicans biofilms［J］．Antimi⁃crob Agents Chemother，2014，58（4）：2344⁃2355．

［5］Tan X，Fuchs BB，Wang Y，et al．The role of Candida albicans SPT20 in filamentation，biofilm formation and pathogenesis［J］．PLoS One，2014，9（4）：e94468．

［6］Mayer FL，Wilson D，Hube B．Candida albicans pathogenicity mechanisms［J］．Virulence，2013，4（2）：119⁃128．

［7］Maglott D，Ostell J，Pruitt KD，et al．Entrez Gene：gene⁃centered information at NCB［J］I．Nucleic Acids Res，2007，35（Databaseissue）：D26⁃31．

［8］Sardi JC，Pitangui NS，Rodriguez⁃Arellanes G，et al．Fusco⁃Almeida AM，Mendes⁃Giannini MJ．Highlights in pathogenic fun⁃gal biofilms［J］．Rev Iberoam Micol，2014，31（1）：22⁃29．

［9］Fan Y，He H，Dong Y，et al．Hyphae⁃specific genes HGC1，ALS3，HWP1，and ECE1 and relevant signaling pathways in Candida albicans［J］．Mycopathologia，2013，176（5⁃6）：329⁃335．

［10］Nobile CJ，Fox EP，Nett JE，et al．A recently evolved transcrip⁃ tional network controls biofilm development in Candida albicans［J］．Cell，2012，148（1⁃2）：126⁃138．

［11］Liu TT，Lee RE，Barker KS，et al．Genome⁃wide expression profi⁃ling of the response to azole，polyene，echinocandin，and pyrimi⁃dine antifungal agents in Candida albicans［J］．Antimicrob A⁃gents Chemother，2005，49（6）：2226⁃2236．

［本文编辑］王飞

A study of function in Candida albicans mutant ORF19．2500

NIU Li⁃da1，CHEN Xiao⁃qing2，ZHAO Jing1，WU Jian⁃hua1，ZHENG Qing⁃hu3
（1．Department of Dermatology，Changhai hospital，Shanghai，200433；2．ShangHai University，Shanghai，200436；3．PLA 153 Central Hospital，Zhengzhou，450042）

ObjectiveFor searching some genes which impacted the formation of Candida albicans biofilm．Then we screened of 50 Candida albicans mutants．So as to identify potential pathogen mechanism of Candida albicans．MethodsScreening 50 Candida albicans mutants in the method of cultivating biofilm in vivo．Biofilm was quantified by XTT．Then the mutants of growth rate and hy⁃phal formation were analyzed．ResultsIt was defected for Candida albicans mutant orf19．2500 to form biofilm which was quantified by XTT．The mutant grows slowly，which was quantified by growth curve and spot assay．Then we find the mutant can not form hyphal in liquid spider media，while it can normally form hyphal in liquid YPD plus 10%fetal bovine serum media．ConclusionThe Candi⁃da albicans mutant orf19．2500 can not utilize liquid media which impacted morphogenetic switching and the biofilm formation．

Candida albicans；orf19．2500；yeast；hyphal；biofilm

R 379．4

A

1673⁃3827（2015）10⁃0070⁃05

国家973项目（2013CB31602）

牛理达，女（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：15721571136＠126．com

吴建华，E⁃mail：wujh＿ch＠163．com；郑庆虎，E⁃mail：zhengqinghu205＠163．com

2014⁃12⁃02