小鼠脑微血管内皮细胞与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析

聂舒　李平　朱红梅　温海（上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海200003）

小鼠脑微血管内皮细胞与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析

聂舒李平朱红梅温海
（上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海200003）

目的探索新生隐球菌GXM能否影响脑微血管内皮细胞基因的表达，为进一步研究隐球菌嗜中枢性的分子机制提供线索。方法使用Roche NimbleGen 12×135K小鼠基因表达谱芯片，筛选小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd．3与不同浓度新生隐球菌GXM作用后差异表达的基因；结合基因本体论（Gene Ontology），使用topGO进行差异基因GO分析，结合GO语义挖掘与隐球菌侵袭中枢神经系统能力相关的差异表达基因的信息；采用荧光实时定量PCR对重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1的表达水平变化加以验证。结果bEnd．3细胞与新生隐球菌GXM作用前后基因表达对比发现，实验组GXM（90 μg／m）组总共有402个基因表达上调，296个基因表达下调，GXM（180 μg／m）组总共有421个基因表达上调，564个基因表达下调，细胞膜、细胞骨架、磷酸肌醇⁃3⁃激酶活化、1⁃磷酸肌醇⁃3⁃激酶活化、细胞紧密连接等生物过程差异表达基因较为富集；对PIK3C2G基因和ADAMDEC1基因表达水平变化进行荧光定量PCR验证，结果与芯片结果一致，基因表达水平不同程度上升，且与GXM浓度正相关。结论新生隐球菌GXM能够影响脑微血管内皮细胞基因表达，PIK3C2G基因、ADAM⁃DEC1基因表达上调可能和隐球菌穿越血脑屏障有关。

脑微血管内皮细胞；新生隐球菌；GXM；基因芯片

［Chin J Mycol，2015，10（2）：84⁃87］

新生隐球菌是一种环境腐生菌，存在于人们日常的生活中，属于担子菌门，广泛分布于全世界的土壤中，特别是鸽子粪便污染的土壤。长久以来认为新生隐球菌仅为机会致病菌，免疫受损和或免疫不全人群易感，但近年来国内外回顾性分析认为新生隐球菌哥特变种，免疫正常人群同样易感［1⁃2］。

随着艾滋病全球形势的日益严峻，器官移植患者的增多，新生隐球菌感染受到越来越广泛的关注。HIV患者并发急性隐球菌性脑膜脑炎后给予积极的抗真菌治疗3个月内死亡率仍接近20%，入院后不予特定抗真菌治疗2周内的死亡率高达100%［3］。器官移植患者中约有2．8%发生侵袭性隐球菌感染［4］，52%～61%患者表现为中枢神经系统受累和播散性感染。播散性隐球菌病感染具有显著的嗜中枢性，约九成以上侵袭中枢神经系统［5］，引起隐球菌性脑膜脑炎，一旦发生中枢系统感染，死亡率高达40%［3］。隐球菌侵袭中枢系统需要跨越我们重要的屏障系统血脑屏障，脑微血管内皮细胞是血脑屏障最重要的细胞。前期研究发现隐球菌能够影响脑微血管内皮细胞基因的表达，为进一步探索隐球菌侵袭中枢系统机制，我们将隐球菌荚膜最主要成分葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖（glucuronoxylomannan，GXM）与脑微血管内皮细胞体外共培养，分析作用前后在整体基因表达水平上变化，并对重要差异表达基因加以验证。

1　材料和方法

1．1材料

bEnd．3细胞系：小鼠永生化脑微血管内皮细胞。购自ATCC（美国模式菌收集中心）。新生隐球菌B3501（血清D型）：中国医学真菌保藏中心隐球菌专业实验室。YPD液体培养基（1 000mL）：分别称取1%酵母膏即为10 g，2%胰蛋白胨即为20 g，2%葡萄糖即为20 g，加入适量去离子水充分溶解，定容到1 000mL，121℃高压灭菌处理约20min，冷却至室温后，放4℃冰箱保存备用；SDA固体培养基（1 000mL）：分别称量1%蛋白胨即10 g，4%葡萄糖即40 g，1．5%琼脂，加适量去离子水充分溶解上述物质，定容至1 000mL，115℃灭菌处理30min，随后在冷却至60℃时，加入氯霉素1 g（比例为1／1 000），充分混匀后即刻铺板，铺板后待培养基冷却至室温后，存于4℃冰箱备用；YNB液体培养基：提前加50 IU／mL的双抗（即为链霉素＋青霉素），放4℃冰箱保存备用；bEnd．3细胞系培养基

（50mL）：41．5mL DMEM，1mL链霉素＋青霉素；7．5mL FBS，放4℃冰箱保存备用。

1．2主要试剂

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、酵母氮基础（YNB）购自Sigma，CTAB配制成0．3%的水溶液置常温备用。酵母提取物、蛋白胨、氯霉素、琼脂糖、NaCl、葡萄糖均为国产分析纯试剂，Trizol购自美国Invitrogen公司，荧光定量PCR试剂盒购自BIOTNT公司。12×135K小鼠基因表达谱芯片购自Roche NimbleGen，并由上海康成生物协助完成检测及数据分析。

1．3方法

隐球菌荚膜多糖GXM的纯化将B3501接种至1 L YNB培养基中培养3～4 d，9 000 r／min离心收集上清，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，出现乳状沉淀，摇晃均匀后置4℃，过夜。将CTAB稀释为0．3%水溶液备用。次日弃上清，尽量风干沉淀。加18mL水溶解沉淀（必要时需搅拌过夜），此时形成稠溶液，为GXM及GalXM混合物。加入2mL 2 mol／L NaCl，然后缓慢加入0．3%CTAB水溶液（约1mL／min），边加边搅拌，CTAB总用量为多糖含量的3倍，即100 mg多糖溶液应加入CTAB 100mL（＝300 mg CTAB）。实际操作中为确保GXM被完全沉淀，CTAB用量稍高于理论值，终点为无新的沉淀产生。9 000 r／min离心10min弃上清，沉淀使用10%乙醇洗一遍，风干，此为CTAB．GXM复合物。然后加12mL 1 mol／L的NaCl溶解沉淀，再加入2．5倍体积无水乙醇沉淀溶液中的GXM，此时CTAB仍存留于溶液中，9 000 r／min高速离心30min，收集沉淀（GXM），用2 mol／L的NaCl溶解沉淀，溶解需过夜或数日，此时会形成极其稠溶液，似甘油。取GXM溶液加至10 KD的透析袋中，密封，将透析袋置于1 M NaCl于4℃透析1 d，再将透析液换成双蒸水透析1周，每天换液，直至形成清亮的溶液，最后再用PBS透析1 d，将GXM溶液置换成PBS，过内毒素清除柱去除内毒素，酚硫酸法测量浓度后存于80℃备用。

脑微血管内皮细胞bEnd．3培养将对数生长期的bEnd．3细胞PBS洗两遍，胰蛋白酶（含ED⁃TA）消化23后加培养基（含血清）终止，收集细胞，使用含有15%FBS的DMEM培养基将细胞计数调整到1106个／mL，接种于25 cm2培养瓶中，每瓶1mL。为了实验的平行性，实验设计为随机区组设计，即同一瓶细胞传瓶，分别标记为区组一（标1、2、3），区组二（标4、5、6）以及区组三（标7、8、9），区组内的瓶细胞随机数表法进入实验组（B组，90 μg／mL GXM）、实验组（C组，180 μg／mL GXM）及对照组（A组，空白组），实验具体分组见表1。次日换液，并PBS洗次，去除漂浮的死亡细胞；待细胞生长至融合状态；大约2 d后，实验组B和C组中分别加入提前制备好的含90 μg／mL GXM、180 μg／mL GXM细胞培养基，并设空白对照A组，加不含GXM的细胞培养基共同培养；相互作用12 d后，分别用5mL PBS洗2次，并尽量吸干残余的PBS，贴壁细胞用于抽提总RNA。

表1　实验分组情况Tab．1　Grouping of experiment

Trizol法抽提总RNA将上述准备好的细胞弃掉培养基，每瓶细胞加入1mL Trizol试剂，反复抽吸吹打，收集细胞裂解液至离心管，送康成公司检测。另取经过同样处理的裂解液提取RNA，进行荧光定量PCR验证，裂解液中加入0．2mL氯仿，混匀，室温静置15min。4℃12 000 r／min离心15min，小心吸取上层水相至另一离心管，加入0．5mL异丙醇室温放置5～10min，4℃12 000 r／min离心10min，弃上清，75%乙醇洗涤1遍后风干。50μL双蒸水溶解样本，60℃水浴5～10min，冻存备用。

反转录合成cDNA反转录采用逆转录试剂盒（BIOTNT公司）。取2μg总RNA，再加入DEPCddH2O至11μL混匀，加入50 μM Oligo（dT）12～18μL，温和混匀，离心。置70℃中持续加热，立即插入冰浴中大于1min。然后在每管中（原来有12μL）加入RT反应液13μL，混合均匀，总体积25μL（反应液：M⁃MLV 5×Reaction Buffer 5μL，10 mM dNT⁃Pmix 1．25μL，Recombinant RNasin 25μL，M⁃MLV 200 units，DEPC H2O加至13μL）。42℃反应60min后，cDNA产物置于⁃20℃保存备用。

实时荧光定量PCR荧光定量PCR采用Re⁃altime PCR试剂盒（BioTNT公司），定量PCR Premix试剂混合物10μL，引物各2μL，cDNA模板1μL，加去离子水至20μL。PCR反应条件：95℃5min→95℃5min→60℃30min→溶解曲线分析（40个循环）。表达水平以2⁃△△Ct表示。引物序列如下：PIK3C2G上游：5＇TGC CTG ATG CTG TAA CCC T 3＇，下游：5＇GTT GTG CTG ACT GAA CCA C 3＇，产物TM 83．6℃，产物长度98 bp；ADAMDEC1上游：5＇TAC CGT CAG CCG TTC TCA T 3＇，下游：5＇GTC ACA CTC TTC TCC CAC A 3＇，产物TM 82．7℃，产物长度136 bp。

2　结　果

2．1基因芯片初步筛选结果

将所有基因表达谱芯片目标基因表达量标准化后，实验组B组、C组脑微血管内皮细胞全基因组转录水平分别与空白对照组A组做横向比较，根据Benjamini Hochberg FDR方法［6］得到修正的P值（即FDR）进行差异基因筛选（Fold Change＞＝2．0，FDR＜＝0．05）。筛选获得B组总共有402个基因上调，296个基因下调；C组总共有421个基因上调，564个基因下调（见图1）。通过使用topGO［7］进行差异基因的GO分析以推断差异表达基因参与的分子功能，未一一列举。标准富集排序后发现TOP10的类目主要为细胞膜、细胞骨架、磷酸肌醇⁃3⁃激酶活化、1⁃磷酸肌醇⁃3⁃激酶活化、细胞紧密连接。

2．2荧光定量PCR验证ADAMDEC1基因、PIK3C2G基因的表达

荧光定量PCR检测发现，实验组ADAMDEC1基因、PIK3C2G基因表达水平较空白对照组A组均明显上调（见图2）。

3　讨　论

隐球菌侵袭中枢神经系统首先需要穿透血脑屏障，脑微血管内皮细胞是维持血脑屏障功能最重要的细胞。前期研究我们发现菌体本身能够影响脑血管内皮细胞的基因表达，并验证了基因CDH10、基因SELENBP1表达明显上调。隐球菌的显著特点是菌体外包被了厚荚膜，其荚膜主要由葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖（GXM）、半乳糖木糖甘露聚糖（GalXM）和甘露糖蛋白（MP）组成，其中GXM占荚膜多糖总质量的88%以上。

本研究将不同浓度GXM与脑微血管内皮细胞共同培养12后筛选基因表达谱中差异表达的基因，采用标准富集法进行GO分析［7］，发现GXM与脑微血管内皮细胞的细胞膜、细胞骨架、磷酸肌醇⁃3⁃激酶活化、1⁃磷酸肌醇⁃3⁃激酶活化、细胞连接等生物过程的基因表达变化相关。我们对表达上升较为明显、功能较为重要的磷酸肌醇3激酶家族的PIK3C2G基因以及解聚素金属蛋白酶家族的AD⁃AMDEC1基因采用RT⁃PCR技术进一步加以验证，发现两者表达上调明显，另一方面也相应验证了芯片结果的可靠性。

图1　差异基因火山图　图2　GXM作用12 h后bEnd．3细胞基因ADAMDEC1、PIK3C2G表达水平变化Fig．1　Clustering analyzing of differential genes　Fig．2　ADAMDEC1，PIK3C2G gene expression changes of bEnd．3 cell after co⁃culturing with differ⁃ent concentrations of GXM for 12 hours

PIK3C2G基因位于12号染色体12p12，编码的产物为PI3K⁃C2γ，属于磷酸肌醇3激酶家族（phos⁃phoinositide 3⁃kinase family，PI3K家族），PI3K家族在信号通路中扮演重要角色，参与细胞增殖、致瘤性转换、细胞存活、细胞移行、细胞内的蛋白质转运等重要生物过程。PIK3C2G基因编码产物PI3K⁃C2γ是PI3Ks家族classⅡ中的C2γ亚型［9⁃10］。目前对PI3K家族的研究主要集中在Ⅰ类的催化和调节功能上，对classⅡ、classⅢ及classⅣ的了解并不多。GO国际功能分类体系提示其在细胞内外信号传导通路、磷脂酸代谢过程、磷脂酰肌醇生物合成过程、趋化作用、磷脂酰肌醇磷酸化等过程中均扮演一定角色，进一步查阅KEGG数据库，可以发现其也参与调整肌动蛋白细胞骨架通路［11］。既往有研究发现隐球菌与宿主脑微血管内皮细胞相互作用过程中，细胞表面能够形成微绒毛样突起［12］，提示涉及宿主细胞肌动蛋白骨架结构的改变。提示我们PIK3C2G基因的上调可能与隐球菌穿越血脑屏障能力有关，需进一步的实验进行验证。

尽管1997年研究者就发现了ADAMDEC1基因，但对它的了解还很局限。ADAMDEC1基因位于染色体8p21．2上，其编码的蛋白decysin1是解聚素金属蛋白酶家族（A Disintergrin And Metalloprotein⁃ ase，ADAM）的一员。Decysin1具有蛋白酶活性，被认为可能在树突状细胞的成熟过程中有重要作用。新近研究发现，隐球菌可利用宿主血液中的蛋白水解酶破坏血管完整性［13］，进而破坏血脑屏障的完整性，进一步穿越血脑屏障，推测金属蛋白酶decysin1表达的上调可能与隐球菌侵袭内皮细胞能力有关，其功能和作用机制值得进一步深入研究。

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［本文编辑］王飞

Gene expression profiling analysis of mouse brain microvascular endothelial cells incubated with glycuro⁃noxylomannan of Cryptococcus neoformans

NIE Shu，LI Ping，ZHU Hong⁃mei，WEN Hai
（Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology and PLA Key Laboratory of Fungal Diseases，Department of Dermatology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China）

ObjectiveTo explore whether cryptococcal capsular polysaccharide GXM can influence the gene expression of cere⁃brovascular endothelial cells and providing clues for further study of the molecular mechanism of cryptococcus addicted to central．

MethodsThe Mouse 12×135K Gene Expression Array manufactured by Roche NimbleGen was used to identify the differentially ex⁃pressed genes of bEnd．3 cells after co⁃culturing with GXM in different levels．TopGO method is used to analyze the differentially ex⁃pressed genes．We analyze differences in gene function with the GO classification function and find information about the literature da⁃ta．The changes of some important genes were found and then validated by RT⁃PCR．ResultsAfter comparison，we got 698 differenti⁃ally expressed genes，including 402 up⁃regulated and 296 down⁃regulated in the GXM（90 μg／mL）group and 985 differentially genes，including 421 up⁃regulated and 564 down⁃regulated in the GXM（180 μg／mL）group．Cryptococcal capsular polysaccharide GXM can regulate vascular endothelial cell gene expression．Genes relating to tight junction，cell transduction，cytoskeleton，metabo⁃lism of cell membrane componentsetc have been impacted．Considering literature and GO analysis results，we selected gene PIK3C2G and gene ADAMDEC1 and validated their expression levels by RT⁃PCR．The results were in line with the microarray data．Conclu⁃sionsCryptococcal capsular polysaccharide GXM can influence the gene expression of cerebrovascular endothelial cells Increase in genetic PIK3C2G，ADAMDEC1 may relate to the ability of cryptococcus invading blood brain barrier．

brain microvascular endothelial cells；C．neoformans；GXM；Gene expression profilinganalysis

R 379．5

A

1673⁃3827（2015）10⁃0084⁃04

国家自然科学基金（31470252，81271800）

聂舒，女（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：nieshu1989＠foxmail．com

温海，E⁃mail：wenhai98＠sohu．com；朱红梅，E⁃mail：hmzhu＿cn＠163．com

2015⁃01⁃26