转录因子RPN4对白念珠菌药物敏感性的研究

许洪涛　唐若愚　屈莺歌　王晓娟　姜远英　曹永兵　颜天华（．中国药科大学药学院，南京98；．第二军医大学药学院新药研究中心，上海004；．上海海洋大学食品学院，上海006）

转录因子RPN4对白念珠菌药物敏感性的研究

许洪涛1，2唐若愚3屈莺歌1，2王晓娟1，2姜远英2曹永兵2颜天华1
（1．中国药科大学药学院，南京211198；2．第二军医大学药学院新药研究中心，上海200433；3．上海海洋大学食品学院，上海201306）

目的利用基因缺失菌库研究转录因子敲除后对白念珠菌药物敏感性的影响，并利用药物敏感性差异菌株初步考察可能的耐药性调控机制。方法微量液基稀释法测定最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）；点板法（spot assay）和生长曲线法验证菌株对氟康唑的敏感性；实时定量PCR（RT⁃PCR）法检测药物敏感性差异菌株中多药耐药基因CDR1和MDR1的表达，并通过罗丹明6G外排实验测定外排能力。结果亲本菌SN250对氟康唑表现为耐药，多药耐药基因CDR1和MDR1高表达，MIC80大于16 μg／mL，大部分转录因子缺失菌与亲本菌SN250表现出相同的耐药性，但转录因子RPN4缺失菌株对氟康唑的敏感性升高，MIC80降为0．5 μg／mL；多药耐药基因CDR1和MDR1的表达均降低，20min和40min时对罗丹明6G的外排能力降低。结论转录因子RPN4有可能通过促进多药耐药基因CDR1和MDR1表达和菌株外排能力而降低对药物的敏感性，但相关机制有待进一步深入研究。

白念珠菌；转录因子；药物敏感性；多药耐药基因

［Chin J Mycol，2015，10（2）：75⁃79］

近年来，随着免疫功能受损患者（接受放疗、化疗、器官移植治疗的患者以及艾滋病患者）的增加，广谱抗生素和免疫抑制剂的长期广泛使用，导致真菌感染特别是深部真菌感染呈上升趋势。在中国，念珠菌导致的深部感染已经居首位［1］。而大多数抗真菌药物都是在上世纪合成的，长期的临床应用导致了大量耐药菌株的产生，导致临床治疗的失败。

随着分子生物学的兴起和发展，人们对于白念珠菌耐药性的研究已经扩展到分子水平，对于耐药的转录调控研究也逐渐成为热门课题，转录因子在调控中发挥着重要的作用。近年来，对白念珠菌转录因子调控作用的研究取得了许多进展，包括从黏附、菌丝的形成到对宿主内环境的适应等过程中转录因子都发挥着重要的调控作用。研究表明，转录因子Aft2与白念珠菌的黏附有关，敲除后导致细胞表面疏水性增加，细胞间的絮结作用增强以及黏附到聚苯乙烯表面的能力增强［2］；转录因子Sfl1负向调节菌丝形成，其过表达会导致菌丝形成的显著减少［3］；在宿主体内，白念珠菌通过转录因子Sfu1、Sef1和Hap43构成的网络调节铁平衡从而适应环境中铁含量的变化［4］；转录因子Pho4与白念珠菌对磷酸盐限制性条件的感受有关，当敲除后在较低的磷酸盐条件下表现出菌丝过度生长，且毒力增加［5］；白念珠菌在不同营养和应激条件下所表现的表型差异与转录因子之间也存在密切联系［6］。此外，Rlm1与细胞壁生物合成有关［7］，Upc2与耐药性有关［8］，转录因子在生物被膜的形成过程中也发挥着重要的作用［9］。

本研究的目的在于筛选不同转录因子缺失菌对药物敏感性的差异，并利用对药物敏感性有差异的缺失菌初步考察白念珠菌的耐药机制。通过微量液基稀释法对30株转录因子敲除菌进行药物敏感性筛选，然后用生长曲线和spot assay验证敲除菌对氟康唑的耐受能力，用实时定量PCR（RT⁃PCR）法检测转录因子敲除菌中多药耐药基因CDR1和MDR1的表达情况，并通过对罗丹明6G的外排考察这些耐药蛋白的外排能力，从而初步探讨转录因子与药物敏感性之间的调控机制。

1　材料和方法

1．1实验菌株与药敏检测

国际实验室通用菌株白念珠菌（Candida albicans）ATCCMYA⁃2876（SC5314）由美国华盛顿乔治敦大学免疫微生物教研室（Department of Mi⁃crobiology and Immunology，Georgetown University，Washington，U．S．A．）的William A．Fonzi教授馈赠。亲本菌SN250和30株白念珠菌转录因子敲除菌由上海生命科学院巴斯德研究所陈昌斌教授惠赠，详见表1。参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的M27⁃A微量液基稀释法测定实验菌株对氟康唑的MIC80。

表1　30株转录因子敲除菌以及转录因子的名称Tab．1　The 30 strains transcription factor knocked out Candida albicans and the names of the transcription factors

1．2培养基

RPMI1640培养液：RPMI1640 10 g，NaHCO32．0 g，吗啉基丙磺酸34．5 g，加三蒸水900mL溶解，1 mol／LNaOH调pH至7．0，三蒸水定容至1 000mL，0．22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。沙堡葡萄糖琼脂固体培养基（SDA）：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加三蒸水900mL溶解，加入2 mg／mL氯霉素水溶液50mL，调整pH至7．0，以三蒸水定容至1 000mL，高压灭菌，4℃保存备用。酵母浸膏蛋白胨葡萄糖（YEPD）培养液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900mL溶解，加入2 mg／mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1 000mL，高压灭菌，4℃保存备用。0．1 mol／L磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8．0 g，KCl 0．4 g，Na2HPO40．133 g，KH2PO40．06 g，NaHCO30．35 g，加三蒸水900mL溶解并定容至1 000mL，高压灭菌，4℃保存备用。

1．3主要试剂

氟康唑氯化钠注射液（fluconazole，FLC，Pfi⁃zer），咪康唑（miconazole，MCZ，Sigma），真菌RNAout制剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司），Prime Script RT Master Mix（TakaRa），SYBR Premix EX Taq（TakaRa），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1．4仪器与装置

T⁃gradient PCR仪、荧光定量real⁃time PCR仪（Bio⁃Rad）；Multiskan MK3型酶标检测仪（Lab⁃system）；MJX型智能霉菌培养箱（宁波江南仪器厂制造）；Eppendorf 5417R高速冷冻离心机（Ep⁃pendorf）。

1．5spot assay实验

首先浇铸含药的YEPD平板：将配制的YEPD高压灭菌，待培养液冷却至不烫手后加入药物，使氟康唑（FLC）和咪康唑（MCZ）的最终浓度均达到4 μg／mL和8 μg／mL，彻底混匀后倒入无菌的平皿上，静置冷却。将菌株在YEPD培养液中分别连续活化2次达到指数生长期后期，3 000×g离心5min，血球计数板计数，用YEPD培养液调整菌液浓度为1×107cell／mL，10倍比稀释得到5个浓度梯度，即1×107cell／mL、1×106cell／mL、1×105cell／mL、1×104cell／mL、1×103cell／mL，取10μL菌液点在含药平板上，于30℃静置培养48 h，观察菌株在平板上的生长情况并拍照记录实验结果。

1．6生长曲线

将白念珠菌以1∶100接种至1mL YEPD培养液，于30℃，200 r／min振荡培养16 h，活化两次，使真菌处于指数生长期后期。用酶标仪测600 nm处的OD值，以YEPD培养液稀释并调整菌液浓度至OD600值为0．1，分别于5mL上述菌液中加入氟康唑，使药物的最终浓度为16 μg／mL。30℃，200 r／min振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、28和32 h时间点取样100μL，用酶标仪测定OD600值，以OD600值确定菌株生长变化。

1．7RT⁃PCR考察多药耐药基因CDR1和MDR1表达水平

采用真菌RNAout试剂盒进行总RNA抽提，用酶标仪检测RNA的浓度和纯度，使其OD260／OD280值介于1．8和2．1之间，并对RNA进行定量。

RNA反转录为cDNA反转录混合反应液体系为5×PrimeScript RT Master Mix 2μL，RNA 500 ng，加RNase Free dH2O至20μL，反转录的反应条件为37℃15min，85℃5 s，4℃冷却。

RT⁃PCR反应引物序列详见表2，TR⁃PCR的反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，50× ROX Reference DyeⅡ0．4μL，Primer F 0．4μL，Primer R 0．4μL，cDNA 2μL，灭菌水6．8μL，反应体系共20μL。RT⁃PCR的反应条件为95℃1min；95℃10 s，循环40次；60℃20 s，循环40次；72℃30 s，循环40次；冷却至室温。

反应结束后记录终止循环阈值（cycle thresh⁃old，Ct），用内参actin的Ct值校正目的基因Ct值，得到ΔCt，比较实验组和对照组的ΔCt得到ΔΔCt，基因表达比值（实验组／对照组）Ratio＝2⁃ΔΔCt。

表2　引物序列和名称Tab．2　The sequence of primers used in this study

1．8罗丹明6G外排实验

按照上述方法活化菌株使其处于指数生长期后期，3000×g离心5min，用PBS洗3次除去培养液，用PBS调整使菌液的OD600值为0．5。将菌液在30℃，200 r／min振荡培养2 h，消耗细胞内的能量，加入终浓度为10 μg／mL的罗丹明6G，30℃，200 r／min振荡培养0．5 h后用PBS洗3次，除去细胞外的罗丹明6G，加入终浓度为2 mg／mL的葡萄糖并开始计时。在20min和40min吸取1mL菌液，离心后检测上清液PBS中的荧光强度，记录并做图。

1．9统计学处理

应用GraphPad Prism 5软件，统计检验采用双侧t检验，P＜0．05则认为差异有统计学意义。

2　结　果

2．1药物敏感性实验

通过微量液基稀释法对30株转录因子敲除菌进行初步筛选，编号为CC003（转录因子RPN4缺失）的菌株对氟康唑敏感性显著升高（以下统称RPN4缺失菌），其MIC80＜0．5 μg／mL。另外，编号为CC001、CC011、CC015、CC016、CC020、CC027、CC029的菌株对氟康唑的敏感性也增加，MIC80为8 μg／mL，编号为CC023的菌株的MIC80降低到4 μg／mL，筛选结果见表3。

表3　白念珠菌转录因子敲除菌对氟康唑的敏感性Tab．3　The susceptibility of transcription factor knocked out Candida albicans to fluconazole

2．2spot assay实验

与亲本菌SN250相比，RPN4缺失菌在YEPD固体培养基上对4 μg／mL和8 μg／mL氟康唑和咪康唑均表现得更加敏感（见图1）。

2．3生长曲线实验

实验表明16 μg／mL氟康唑对RPN4缺失菌的抑制作用更明显，进一步证明转录因子RPN4敲除后菌株对氟康唑变得更敏感（见图2）。

2．4SC5314、SN250和RPN4缺失菌中CDR1和MDR1的表达

根据RT⁃PCR实验获得的Ct值和计算获得的Ratio值可知：SC5314和RPN4缺失菌中多药耐药基因CDR1和MDR1的表达都低于SN250（见图3）。

2．5罗丹明6G外排实验

在20min和40min时，SN250对罗丹明6G的外排能力都明显高于RPN4缺失菌（见图4）。

3　讨　论

目前，临床上广泛使用的抗真菌药物尤其是唑类药物耐药现象非常严重，而真菌耐药性的产生涉及多种机制，典型的包括：多药耐药基因CDR1和MDR1的表达增加；药物靶酶的变异；生物被膜的形成等［10］。转录因子RPN4在酿酒酵母和白念珠菌中都有同源物，能够调节蛋白酶体基因的表达［11］，在重金属、渗透应激和氧化应激下表达增加［12］。而研究发现氧化应激能够上调MDR1的表达，从而导致白念珠菌产生耐药性［13］。根据这些研究和我们的实验结果，我们提出了这样一个假设：氧化应激可能先上调RPN4的表达，而RPN4表达的增加又导致MDR1表达增加，而这个假设是否正确还有待继续研究。

本研究通过微量液基稀释法、spot assay实验和生长曲线实验都证明了与亲本菌SN250相比，转录因子RPN4敲除后导致对氟康唑的敏感性明显升高，表明这个转录因子可能参与白念珠菌对药物敏感性的调节。为进一步探讨其分子机制，利用RT⁃PCR对RPN4缺失菌中多药耐药基因CDR1和MDR1的表达进行检测，发现在RPN4缺失菌中CDR1和MDR1的表达均低于亲本菌SN250。罗丹明6G外排实验进一步从功能方面验证了这些多药耐药蛋白外排能力的降低。耐药基因表达的降低会导致菌株对药物的敏感性升高，这些耐药基因的表达降低可能与RPN4缺失菌对氟康唑的敏感性升高有关。

图1　点板实验结果：a．YEPD＋4 μg／mL氟康唑，b．YEPD＋8 μg／mL氟康唑，c．YEPD＋4 μg／mL咪康唑，d．YEPD＋8 μg／mL咪康唑　图2　生长曲线结果：a．不加药空白组，b．16 μg／mL氟康唑组　图3　SC5314、SN250和CC003中CDR1和MDR1的表达　图4　SN250和CC003对罗丹明6G的外排实验Fig．1　The results of spot assay：a．YEPD＋4 μg／mL fluconazole，b．YEPD＋8 μg／mL fluconazole，c．YEPD＋4 μg／mL miconazole，d．YEPD＋8 μg／mL miconazole　Fig．2　The results of growth curve：a．Control group，b．16 μg／mL fluconazole group　Fig．3　The expression of the multidrug resistance genes CDR1 and MDR1 in Candida albicans SC5314，SN250 and strain CC003（n＝3，±s，SN250 vs CC003，∗P＜0．05）　Fig．4　The ability of Candida albicans SN250 and CC003 to pump out rhodamine 6G（n＝3，±s，SN250 vs CC003，∗∗P＜0．01，∗P＜0．05）

本研究探讨转录因子RPN4敲除后与药物敏感性之间的联系及其机制，发现转录因子RPN4缺失后导致耐药基因CDR1和MDR1表达降低从而导致缺失菌的药物敏感性升高。然而，白念珠菌对药物敏感性的调节涉及多种机制，对于其具体的调控过程还有待于进一步研究。

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［本文编辑］施慧

Analysis of relationship between transcription factor RPN4 and drug susceptibility of Candida albicans

XU Hong⁃tao1，2，TANG Ruo⁃yu3，QU Ying⁃ge1，2，WANG Xiao⁃juan1，2，JIANG Yuan⁃ying2，CAO Yong⁃bing2，YAN Tian⁃hua1
（1．College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198；2．New Drug Research and Development Center，College of Pharmacy，The Second Military Medical University，Shanghai 200433；3．College of Food Science and Technology，ShangHai Ocean University，Shanghai 201306）

ObjectiveTo study the influence on the drug susceptibility of Candida albicans after transcription factor RPN4 was knocked out and the mechanism how this transcription factor regulates the drug susceptibility in Candida albicans．MethodsThe broth microdilution method was used to determine theminimal inhibitory concentrations（MICs）of 30 strains transcription factor knocked out Candida albicans．The drug susceptibility was reassured by spot assay and growth curve．The total RNA of parental strain SN250 and susceptible strains were extracted and the expression of multidrug resistance genes CDR1 and MDR1 was determined by real⁃time PCR，and the pump ability was examined by the ability of pump out rhodamine 6G．ResultsCompaired to the parental strain SN250，transcription factor RPN4 knocked out strain was more susceptible to fluconazole．The expression of CDR1 and MDR1 was lower than SN250 and the pump ability was also weaker than SN250．ConclusionThe knockout of transcription factor PRN4 re⁃sults susceptible to fluconazole in Candida albicans，and this transcription factor may be involved in the regulation of drug susceptibil⁃ity in Candida albicans．

Candida albicans；transcription factors；drug susceptibility；multidrug resistance genes

R 379．4

A

1673⁃3827（2015）10⁃0075⁃05

国家自然科学基金（81173100），上海市基础研究重点课题（11JC1415400）

许洪涛，男（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：xhthfut＠163．com

颜天华，E⁃mail：18915991229＠126．com

2015⁃03⁃13