新生隐球菌转录共激活因子MBF1基因的鉴定与敲除

周兆婧　孟云芳　赵静宇　桑军军　张超　法振宗　方伟　廖万清（．上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海00003；．上海长征医院皮肤科，上海00003；3．上海市皮肤病医院，上海00050）

新生隐球菌转录共激活因子MBF1基因的鉴定与敲除

周兆婧1，2孟云芳1，2赵静宇1，3桑军军1张超1法振宗1方伟2廖万清1，2
（1．上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海200003；2．上海长征医院皮肤科，上海200003；3．上海市皮肤病医院，上海200050）

目的构建新生隐球菌转录共激活因子MBF1基因缺陷菌株。方法采用套叠PCR方法，构建含有抗性基因NEO以及靶基因上下游同源DNA片段的基因敲除框，通过基因枪将重组片段转化入新生隐球菌，应用PCR筛选和DNA序列测序方法对基因突变株进行鉴定与验证。结果成功构建了新生隐球菌基因突变株mbf1△。结论通过基因突变株mbf1△的构建，为深入研究新生隐球菌转录辅助因子Mbf1的功能机制奠定基础。

新生隐球菌；致病机制；基因敲除

［Chin J Mycol，2015，10（2）：80⁃83］

隐球菌病（Cryptococcosis）是临床上最重要的侵袭性真菌感染之一，其主要致病病原体为新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）和格特隐球菌（Cryptococcus gatti），主要通过孢子吸入、直接接种或血行播散感染免疫功能抑制的人群，可引发具有致命威胁的脑膜脑炎。近年来AIDS蔓延扩散，细胞／器官移植、化疗、免疫抑制剂以及各类置管等侵袭性诊疗技术进一步推广，隐球菌病在全球范围内呈现出一定的上升趋势，据有关统计数据，每年约600 000例患者死于隐球菌感染［1⁃2］。

随着分子生物学、遗传学技术的迅猛发展，隐球菌作为一种模式病原真菌应用于分子诊断、致病机制、治疗新靶点的研究［3⁃5］。多蛋白桥接因子1（Multiprotein bridging factor1，Mbf1）是真核生物中普遍存在的一种转录辅激活蛋白，主要通过特异性结合转录因子、连接TATA盒从而激活基因转录，对真核生物基因表达和转录调控发挥十分重要的作用［6⁃7］。目前已证实，Mbf1可能参与调控真核细胞激素分泌、脂类代谢、组氨酸代谢等多种生物学过程，其生物功能可能通过介导转录激活因子Gcn4发挥作用［7］。在此基础上，本研究以新生隐球菌为背景菌株，通过同源重组的方法构建新生隐球菌MBF1基因突变株，为进一步研究其对病原真菌的生长和毒力调控作用及机制奠定基础。

1　材料与方法

1．1材料

菌株与质粒新生隐球菌格鲁比变种（C．neoformans var．grubii）标准株H99、质粒pJAF⁃1（含有报告基因NEO）均由本实验室提供［8］。

培养基与主要试剂以YPD为酵母细胞基础培养基，加入1 mol／L山梨醇、200 mg／L遗传霉素G418（Sigma⁃aldrich公司）分别作为隐球菌的基因敲除保护培养基和抗性筛选培养基。DNA聚合酶（EasyTaq、FastPfu等）、电泳凝胶回收试剂盒、酵母基因组抽提试剂盒等均购自TransGen Biotech公司。

主要仪器电泳凝胶成像系统、BioRad基因枪、PCR仪、微量分光光度计等仪器设备均由本实验室提供。

1．2实验方法

生物信息学分析从隐球菌（www．broadin⁃stitute．org／annotation／genome／cryptococcus＿neofor⁃mans）基因组数据库以及NCBI蛋白数据库（www．ncbi．nlm．nih．gov／protein）获得新生隐球菌以及其他真核生物物种转录共激活因子Mbf1的氨基酸序列。应用在线生物信息学软件tblastn对比不同生物种间Mbf1的蛋白差异，应用Pfam数据库（http：／／pfam．sanger．ac．uk／）对其进行结构域分析，同时应用DNASTAR软件中的Clustal W alignment软件对重要真核生物中的Mbf1同源蛋白系统进化分析。

构建基因重组突变框以H99基因组为模板，根据新生隐球菌基因组数据库中的MBF1基因序列（CNAG＿04637）设计上下游的两对扩增引物M5F／M5R和M3F／M3R（见表1），合成同源基因片段5⁃FR、3⁃FR片段；以质粒pJAF⁃1 DNA为模板，根据引物M13F、M13R（详见表1）合成抗性基因NEO片段。将上述纯化后的基因片段等摩尔浓度为模板，应用引物M5F、M3R合成基因同源重组突变框。PCR反应条件：94℃5min，94℃30 s， 55℃30 s，72℃1min（1 kb／min），35个循环后72℃10min。

表1　引物列表Tab．1　Primers list

新生隐球菌MBF1的基因敲除取新生隐球菌H99单克隆接种于YPD液体培养基中，30℃摇菌16～18 h，无菌双蒸水洗脱2遍后，用无菌玻璃珠均匀涂布于保护性培养基平皿（YPD＋1M山梨醇）上作为感受态细胞。将纯化后的基因重组片段经基因枪转入新生隐球菌感受态细胞中，30℃孵育4 h后转至抗性培养基平皿（YPD＋G418）中筛选孵育［9］。同时，以未转化的H99感受态细胞涂布于抗性培养基上作为阴性对照。

阳性克隆的筛选与验证从筛选抗性平板中挑取单克隆，应用酵母基因组DNA提取试剂盒抽提其DNA，分别应用两对引物M⁃DP⁃F／NEO⁃R和M⁃DP⁃R／NEO⁃F进行PCR验证。在此基础上，取电泳条带正确的阳性克隆子扩增片段进行DNA测序验证。

2　结　果

2．1生物信息学分析

新生隐球菌转录共激活因子Mbf1包含150个氨基酸，主要由MBF1（Multiprotein bridging factor 1）和HTH3（Helix⁃turn⁃helix）两个结构域组成。通过生物信息学分析，我们发现不同真核生物物种的Mbf1同源蛋白之间结构高度相似，均由类似的结构域组成（见图1）。系统进化树分析进一步提示Mbf1在不同真核物种进化过程中存在较高的结构保守性，这种进化上的一致性为我们预测并比较不同真核生物转录共激活因子Mbf1的功能提供了理论依据（见图2）。

2．2基因重组突变框的构建

我们首先利用CTAB法获得新生隐球菌H99基因组［8］，以此为模板扩增目的基因MBF1上、下游同源的核苷酸序列片段（5⁃FR，929 bp；3⁃FR，926 bp），从质粒载体pJAF中获得抗性基因NEO（2 098 bp）片段，PCR产物的电泳结果（见图3），电泳条带完全符合预期。将上述PCR产物电泳凝胶回收，二次PCR反应获得靶基因MBF1的同源重组突变框（KO，3 953 bp），PCR产物电泳结果如图3，完全符合预期，提示我们基因敲除框构建成功。

2．3基因敲除与验证

将上述重组DNA片段经基因枪转化入新生隐球菌的感受态细胞，经抗性选择培养基筛选后获得十余个阳性克隆菌落，阴性对照无菌落生长，提示我们实验结果可靠。随机挑选4个转化菌落，提取其基因组后行PCR初步筛选鉴定，分别使用引物M⁃DP⁃F／NEO⁃R（2 151 bp）和M⁃DP⁃R／NEO⁃F（2 840 bp），扩增片段电泳结果完全符合预期（见图4），将其中筛选正确的菌株相应的PCR产物分别送DNA测序，测序序列进行核苷酸比对后完全正确（结果未展示），提示我们新生隐球菌基因突变株mbf1Δ（mbf1：：NEO）构建完全正确。

3　讨　论

MBF1是真核生物在长期进化过程中形成的一种高度保守的转录共激活因子，通过桥接转录因子DNA序列结合区和TATA盒耦联蛋白实现基因转录调控，从而调节真核细胞的各种生物学活动［7］。通过生物信息学分析，我们发现Mbf1主要包含N末端的MBF1结构域（结合转录激活子）和C末端的HTH结构域（结合TATA盒耦联蛋白），后者包含有4个α螺旋结构，和1个保守的尾部结构，考虑可能与其蛋白保守性密切相关［10］。

在功能研究方面，Mbf1蛋白在古菌、植物中研究较多，主要参与调控氧化应激应答、高温耐受以及生长发育等多种生物学过程［11］。在拟南芥中，Mbf1基因沉默可导致种子发芽减少、植株生长矮小［12］，而转录共激活因子基因过表达后则对高温、高渗和（或）细菌感染显示了更强的耐受力［13⁃14］。真菌领域Mbf1功能机制研究相对较少，鉴于其蛋白结构上的高度保守性，我们设想Mbf1可能对隐球菌的应激应答、有性繁殖等生物学过程具有类似的调控功能。本研究已成功构建基因突变株mbf1Δ，后续的功能机制研究将可进一步解决这一疑问。

关于隐球菌未知蛋白的功能机制研究，常用的分子生物学方法主要有基因敲除、基因沉默（RNA干扰）以及土壤根瘤杆菌（Agrobacterium tumefa⁃ciens）转化等方法，其中以基因敲除最为常见。基因敲除，主要利用基因同源重组原理，通过电转化或高压氦气轰击等方法实现靶基因的定向置换与突变。在本实验中，我们利用套叠PCR法构建基因突变框，将重组PCR片段利用基因枪转入隐球菌细胞内，相较于应用重组质粒构建同源片段［15⁃16］，转化效率更高、异位整合错配发生率更低、对靶基因邻近基因的表达影响更小［17］。与此同时，mbf1Δ突变株的成功构建，进一步提示该基因并非新生隐球菌的必需基因，并为后续进一步探索其在新生隐球菌的毒力因子应答、基因转录调控等生物学过程的功能影响奠定了重要的基础。

图1　不同真核生物种Mbf1蛋白结构域的生物信息学分析　图2　Mbf1同源蛋白的系统进化分析　图3　套叠PCR法合成目的基因的同源重组突变框片段。3’端同源序列（3⁃FR，926 bp），5’端同源序列（5⁃FR，929 bp），报告基因片段（NEO，2 098 bp），基因同源重组敲除框（KO，3 953 bp）　图4　PCR检测基因突变株。以隐球菌标准株H99基因组DNA为阴性对照，L1⁃4由引物M⁃DP⁃F／NEO⁃R扩增（2 151 bp），L1⁃4’（2 840 bp）和H99’由引物M⁃DP⁃R／NEO⁃F．扩增Fig．1　Bioinformatics analysis of Mbf1 domain structures among different eukaryotic species　Fig．2　Phylogenetic analysis of Mbf1 orthologs among different eukaryotic species　Fig．3　Construction of MBF1 homologous recombination cassette with overlap PCR　Fig．4　Screening of correct mutant strains by diagnostic PCR

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［本文编辑］卫凤莲

Identification and knocking⁃out of transcription co⁃activation factor gene MBF1 in Cryptococcus neoformans

ZHOU Zhao⁃jing1，2，MENG Yun⁃fang1，2，ZHAO Jing⁃yu1，3，SANG Jun⁃jun1，ZHANG Chao1，FA Zhen⁃zong1，FANG Wei2，LIAO Wan⁃qing1，2
（1．Institute of dermatology and fungal disease，Key Laboratory of the army fungal disease，Shanghai 200003；2．Department of derma⁃tology，Changzheng Hospital，Shanghai 200003；3．Dermatology Hospital of Shanghai，Shanghai 200003）

ObjectiveTo construct the mutant strain of transcriptional co⁃activated factor Mbf1 in Cryptococcus neoformans．

MethodsAmplified the homologous recombination cassette containing report gene NEO and flanking DNA fragments of MBF1 via overlap PCR，which was then transformed into Cryptococcus neoformans through gene gun．The positive transformants was screened by diagnostic PCR and then confirmed by DNA sequencing．Results The target gene MBF1 was successfully knocked out in Cryptococcus neoformans．ConclusionConstruction of the mutant strain would lay the foundation for further pathogenetic studies research of tran⁃scriptional co⁃activated factor Mbf1 in Cryptococcus neoformans．

Cryptococcus neoformans；Pathogenesis；Gene Knocking⁃out．

R 379．5

A

1673⁃3827（2015）10⁃0080⁃04

国家973项目（2013CB531601）；上海市自然科学基金（12ZR1454400，12JC1411000）；上海市医学真菌分子生物学实验室基金（14DZ2272900）

周兆婧，女（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：zhouzhao⁃jing320＠163．com

廖万清，E⁃mail：liaowanqing＠sohu．com；方伟，E⁃mail：wei⁃fang081782＠163．com

2014⁃12⁃18