波氏假阿利什霉复合种对4种抗真菌药物的敏感性研究

王红　万喆　余进（北京大学第一医院皮肤科北京大学真菌和真菌病研究中心皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京100034）

波氏假阿利什霉复合种对4种抗真菌药物的敏感性研究

王红万喆余进
（北京大学第一医院皮肤科北京大学真菌和真菌病研究中心皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京100034）

目的对23株分子鉴定为赛多孢霉复合种的菌株检测其对伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和两性霉素B的敏感性。方法参照美国临床实验室标准化研究所制定的M38⁃A2方案，检测临床来源的9株波氏假阿利什霉（Pseudallescheria boydii）、6株P．ellipsoidea、1株P．angusta、1株P．fusoidea和6株尖端赛多孢（Scedosporium apiospermum）对伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和两性霉素B的MIC值。结果伏立康唑对所有受试菌株的MIC值为0．25～1 μg／mL，泊沙康唑为2～4 μg／mL。伊曲康唑对P．ellipsoidea、尖端赛多孢的MIC值为2～＞16 μg／mL，对波氏假阿利什霉、P．angusta、P．fusoidea的MIC值为2～4 μg／mL。两性霉素B对5种菌的MIC值均为为4～＞16 μg／mL。结论伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和两性霉素B对波氏假阿利什复合种中不同种的敏感性未见明显差异。该复合种对伏立康唑最敏感，泊沙康唑其次，伊曲康唑变化较大，两性霉素B的效果最差。

波氏假阿利什霉复合种；伏立康唑；泊沙康唑；伊曲康唑；两性霉素B

［Chin J Mycol，2015，10（2）：96⁃99］

赛多孢霉是近年来临床逐渐增多的一种条件致病性真菌。赛多霉感染多见于恶性肿瘤、肺囊性纤维化患者以及溺水者，主要累及皮肤、眼、肺及脑；也可播散全身［1⁃3］。播散性赛多孢霉感染在多个国家均有报道，包括澳大利亚、美国、加拿大、德国、法国和荷兰。来自西班牙尤其北部地区的报告更多。

近年来，分子分类学研究显示既往波氏假阿利什霉复合种表现的真菌更倾向于是一个复合种［4］，这个复合种包含5个分支：其中前4个分支只有1个种，分别为Scedosporium aurantiacum、Pseudalle⁃scheriaminutispora、S．dehoogi、尖端赛多孢（S．apio⁃spermum）；第5个进化支有4个种，包括波氏假阿利什霉（P．boydii），P．ellipsoidea、P．angusta和P．fu⁃soidea。其中S．apiospermum这个分支和第五个分支在分子上亲缘关系较近，形态学上也相似。S．aurantiacum、P．minutispora、S．dehoogi与其他种在形态学上容易区分。赛多孢属还包括多育赛多孢（S．prolificans），但在亲缘关系上与其他种相距较远。本研究利用已经过本中心分子鉴定的23株临床分离株［5］，在此基础上对赛多孢霉复合种的不同种进行4种抗真菌药物的体外药敏研究，比较不同种对抗真菌药物的敏感性差异。

1　材料与方法

1．1受试菌株

共23株形态鉴定为波氏假阿利什霉复合种的临床分离株，来源于痰、脑积液、肺泡灌洗液和眼分泌物等。其中9株为波氏假阿利什霉，编号分别为BMU00488、BMU01112、BMU01113、BMU01114、BMU01116、BMU01272、BMU02948、BMU07224和BMU07374；6株P．ellipsoidea，编号分别为BMU01118、BMU04730、BMU04772、BMU04780、BMU05145和BMU07108；1株P．angusta，编号为BMU01115；1株P．fusoidea，编号为BMU01297；6株尖端赛多孢，编号分别为BMU00491、BMU01117、BMU03882、BMU04111、BMU04729和BMU07462。菌种均保藏于北京大学真菌和真菌病研究中心／北京大学第一医院皮肤性病科真菌室。抗真菌药物敏感性试验所用质控菌株为黄曲霉ATCC204304。

1．2试验用药物

伊曲康唑（ITC，中国药品生物制品检定所，批号100631⁃200401，纯度99．3%）、伏立康唑（VRC，山东省寿光富康制药公司，批号070724，纯度99．3%）、泊沙康唑（POS，Merck公司，批号171228⁃49⁃2，纯度＞99%）和两性霉素B（AMB，美国sigma，批号1397⁃89⁃3），用100%分析纯度二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶解，储存液的浓度为1 600 μg／mL，药物储存液于⁃30℃保存备用。

1．3菌悬液制备

受试菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，35℃活化7 d。取PDA上的菌落，加入4mL生理盐水，反复吹吸混匀后，将菌悬液吸到无菌试管中。以血球计数板调整孢子浓度为（1～5）×106mL，再以RPMI 1640液体培养基进一步稀释50倍，即为2倍于最终接种浓度的孢子悬液。

1．4抗真菌药物体外抑菌活性测定

参照CLSI制定的丝状真菌药敏方案M38⁃A2。采用微量液基稀释法，分别将VRC、POS、ITC和AMB的药物储存液以RPMI 1640液基倍比稀释，配制成2倍于终浓度的药液，加入96孔圆底药敏板。VRC、POS、ITC和AMB的工作浓度均为0．03～16 μg／mL。取100μL药液分别加入第1～10列各孔，第11列中加入100μL RPMI 1640。第12列设立阴性对照。向第1～11孔分别加入100μL菌悬液后，35℃孵育48 h、72 h判读结果。VRC、POS、ITC和AMB的MIC均定义为与生长对照孔相比生长100%受抑制所对应的最低药物浓度。所有药敏试验均重复操作3遍。

2　结　果

2．14种抗真菌药物对23株波氏假性阿利什霉复合种的体外抑菌作用

4种抗真菌药物对23株赛多孢霉的药敏结果见表1。伏立康唑对所有受试菌株均敏感，MIC范围为0．25～1 μg／mL，GM值为0．46 μg／mL。泊沙康唑其次，MIC范围2～4 μg／mL，GM值为2．62 μg／mL。伊曲康唑对3株P．elliposoidea和2株尖端赛多孢的MIC值为＞16 μg／mL，其余菌株MIC范围为2～4 μg／mL，对所有菌株的GM值为5．25 μg／mL。两性霉素B对3株波氏假阿利什霉、2株P．ellipsoidea、1株P．fusoidea和1株尖端赛多孢不敏感，MIC值为≥16 μg／mL，其余菌株的MIC值为4 μg／mL、8 μg／mL，对所有菌株的GM值为9．02 μg／mL。

2．25种波氏假性阿利什霉复合种对抗真菌药物体外敏感性比较

4种抗真菌药物对5种菌的药敏结果见表2。伏立康唑对波氏假阿利什霉、P．ellipsoidea和尖端赛多孢均敏感；泊沙康唑其次；伊曲康唑对P．ellip⁃soidea、尖端赛多孢的MIC值范围为2～＞16 μg／mL，菌株间差异较大；对波氏假阿利什霉的MIC值范围为2～4 μg／mL，菌株间差异较小；两性霉素B对波氏假阿利什霉、P．ellipsoidea和尖端赛多孢的MIC值范围均为为4～＞16 μg／mL，GM值差别也不大，分别为8．64μg／mL、8．56μg／mL和8．00μg／ellipsoidea和尖端赛多孢二者均为6株，P．angusta、P．fusoidea各1株。

表1　VRC、ITC、POS和AMB对23株病原真菌的最低抑菌浓度（MIC）（μg／mL）Tab．1　The MIC results of 23 pathogenic fungi to VRC，POS，ITC and AMB（μg／mL）

表2　4种抗真菌药对不同种名的赛多孢霉的MIC值范围和GM值（μg／mL）Tab．2　The MIC range and GM value of four anti⁃fungus drugs against different species（μg／mL）

波氏假阿利什霉复合种的体外药敏实验研究mL。本中心中P．angusta、P．fusoidea各一株：VRC、POS、ITC和AMB对P．angust和P．fusoidea的药物敏感性与波氏假阿利什霉类似。

3　讨　论

波氏假性阿利什霉复合种是一类致病丝状真菌，其形态特征为在沙氏或马铃薯培养基上生长迅速，培养7～10 d其菌落表现为白色、绒毛状，气生菌丝多，迅速布满培养皿，日久变为烟灰色，背面为灰黑色。显微镜下菌丝1～3 μm宽，透明分隔，可分支。环痕产孢，环痕孢子近球形至椭圆形，无色，基部短缩。分生孢子梗可长可短，分生孢子单个着生于分生孢子梗顶端，有时可以产生数个孢子；还有一种产孢方式，为粘束孢的产孢方式。部分菌株培养时可以产生子囊。近来有学者提出复合种概念，对表现为波氏假阿利什霉样的真菌进行了细分，依靠多种分子标记区分出若干种。这些分子标记中常用的为β⁃微管蛋白（BT2或TUB）、钙调蛋白（calmodulin，CAL）和内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS），其中BT2和CAL分辨率较高，ITS区较差［4］。波氏假阿利什霉复合种中有致病报道的为波氏假阿利什霉、P．ellipsoidea、P．angus⁃ta、P．fusoidea、S．aurantiacum和尖端赛多孢。P．minutispora多为环境来源，临床报道只有两例。波氏假阿利什霉复合种感染呈地区性分布，在奥地利、澳大利亚和德国，尖端赛多孢为最常见的种，而在西班牙和法国波氏假阿利什霉为最常见种［6⁃8］。S．aurantiacum临床致病报道多来自于澳大利亚。我们对保藏于我中心的23株临床分离株重新鉴定发现波氏假阿利什霉最为常见，为9株，其次为P．多较早，但基于最新的分类命名的研究相对较少。国外学者［9⁃11］在对波氏假阿利什霉复合种进行分子分类前进行的体外药敏实验发现，伏立康唑是最有效的药物，其最低抑菌浓度的几何均数为0．61μg／mL；泊沙康唑为第二位有效药物，两性霉素B并不是对所有菌株都有效。

在对菌株重新分类后，我们对波氏假性阿利什霉复合种的体外药物敏感性做了新的总结。对于波氏假阿利什霉，伏立康唑对其最敏感，泊沙康唑和伊曲康唑对其的敏感性其次，两性霉素B对其的敏感性最差；对于P．ellipsoidea，伏立康唑对其敏感性最好，泊沙康唑其次，伊曲康唑和两性霉素B对其的敏感性较差；P．angusta和P．fusoidea对这4种抗真菌药物的敏感性与波氏假阿利什霉相似，但由于本研究中，P．angusta和P．fusoidea各只有一株，有一定局限性；尖端赛多孢对本研究中的4种抗真菌药物的敏感性与P．ellipsoidea相似，但伊曲康唑对尖端赛多孢比P．ellipsoidea敏感。Lackner等［8，12⁃13］也在重新分类后对尖端赛多孢／波氏假阿利什霉进行了体外药敏实验，发现伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B对P．apiosperma、P．boydii、P．minutispora、P．angusta、P．fusoidea和尖端赛多孢的药物敏感性与种类无明显相关性。伏立康唑和泊沙康唑对S．aurantiacum较敏感。S．dehoogii几乎对所有抗真菌药耐药，即使伏立康唑对其的MIC值也大于16 μg／mL。至今全世界S．dehoogii感染的报道只有3例，国内未有报道。研究显示真菌耐药性在波氏假阿利什霉复合种中随机分布，与种类无明显相关关系。这与本研究结果类似。某些我国未见或罕见种，比如S．aurantiacum、S．dehoogii和多育赛多孢，它们的抗菌谱与其他种不同［13］。

赛多孢霉属除了波氏假阿利什霉复合种外，还包括多育赛多孢。多育赛多孢感染可发生于免疫缺陷的患者，常可致命，几乎对所有的抗真菌药（伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、两性霉素B及卡泊芬净）都耐药。多育赛多孢霉我国仅两例报告，感染率很低［14⁃15］。

联合用药是对耐药菌株治疗的一种选择。我们也曾对23株菌中的15株菌进行了体外联合药敏实验的研究，发现卡泊芬净与伊曲康唑联合时，全部菌株显示为协同作用；卡泊芬净与两性霉素B联合时，有27%的菌株显示为协同作用；卡泊芬净与伏立康唑联合时，均表现为无关作用［16］。Cuenca⁃Estrella等［17］也发现唑类药物和棘白菌素类联合对波氏假阿利什霉复合组有协同作用，与伏立康唑联合时，协同作用最弱，泊沙康唑其次，伊曲康唑最强。特比萘芬和伏立康唑联合对多育赛多孢有协同作用。

对于本研究的4种抗真菌药物，伏立康唑最敏感，泊沙康唑其次，伊曲康唑变异较大，两性霉素B最差。目前就我们结果来看，所有受试菌株对伏立康唑和泊沙康唑的敏感性差别不大，伊曲康唑在P．ellipsoidea和尖端赛多孢两种内差异较大，鉴别到种是否要成为常规还依赖于临床需要。真菌种的差别并不代表着真菌药物敏感性的的不同，因此在治疗前对致病菌株进行体外药敏实验仍是必需的。

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［本文编辑］王飞

In vitro susceptibility test of clinical isolates of Pseudallescheria boydii complex to four anti⁃fungus agents

WANG Hong，WAN Zhe，YU Jin
（Department of Dermatology and Venereology，Peking University First Hospital，Research Center for Medical Mycology，Peking Universi⁃ty，Beijing 100034，China）

ObjectiveTo determine the in vitro susceptibility of Pseudallescheria boydii complex to voriconazole（VRC），posaconazole（POS），itraconazole（ITC）and amphotericin B（AMB）．MethodsThe MICs of VRC，POS，ITC and AMB were deter⁃mined according to M38⁃A2 methods in nine isolates of P．boydii，six isolates of P．ellipsoidea，one isolate of P．angusta，one isolate of P．fusoidea and six isolates of S．apiospermum．ResultsThe MIC range of VRC and POS were 0．25⁃1 μg／mL and 2⁃4 μg／mL．ITC had higher MIC range which was 2⁃＞16 μg／mL against P．ellipsoidea and S．apiospermum than P．boydii，P．angusta，and P．fusoidea（2⁃4 μg／mL）．The MIC range of AMB against all the species was 4⁃＞16 μg／mL．ConclusionVRC，POS，ITC and AMB have the similar susceptibility patterns against various types of Pseudallescheria boydii complex．Since ITC was more sensitive to P．boydii，P．angusta and P．fusoidea than P．ellipsoidea and S．apiospermum in our study，VRC is the most sensitive drug against all the types and than POS and AMB is the worst one among the four drugs．

Pseudallescheria boydii complex；voriconazole；posaconazole；itraconazole；amphotericin B

R 379．9

A

1673⁃3827（2015）10⁃0096⁃04

王红，女（汉族），硕士研究生在读．E⁃mail：wanghong5018＠126．com

余进，E⁃mail：yujin＠medmail．com．cn

2014⁃10⁃21