隐球菌感染体外血脑屏障模型的构建与应用

孟云芳　法振宗　方伟　周兆婧　伊九　顾菊林　廖万清（上海市医学真菌分子生物学重点实验室上海市医学真菌研究所上海长征医院皮肤科，上海200003）

隐球菌感染体外血脑屏障模型的构建与应用

孟云芳法振宗方伟周兆婧伊九顾菊林廖万清
（上海市医学真菌分子生物学重点实验室上海市医学真菌研究所上海长征医院皮肤科，上海200003）

目的构建体外血脑屏障模型，并检测隐球菌不同菌株穿越血脑屏障的能力。方法本研究应用商品化的小鼠脑微血管内皮细胞系bEND．3构建体外血脑屏障模型，并验证该模型应用于隐球菌穿越血脑屏障机制研究的可行性。通过构建模型，以非致病性的酿酒酵母作为阴性对照，比较新生隐球菌不同血清型标准株及基因缺陷株穿越体外血脑屏障能力的差异。结果跨膜电阻值（TEER）检测提示体外血脑屏障模型构建成功。检测结果显示酿酒酵母作为阴性对照穿越血脑屏障效率最低，新生隐球菌血清A型标准株H99穿越细胞屏障效率最强，血清D型标准株JEC21穿越细胞屏障效率显著低于H99。较之H99，黑色素酶缺陷株lac1△穿越体外血脑屏障模型的效率没有显著差异；尿素酶缺陷株ure1△效率显著下降（P＜0．05），约为标准株H99通过率的59．9%；荚膜缺陷株cap59△突破体外血脑屏障模型效率最低，约为标准株H99的18%（P＜0．001）。结论隐球菌中枢系统感染体外模型成功构建。新生隐球菌突破血脑屏障的能力与其血清型以及荚膜、尿素酶等毒力因子的表达密切相关。

新生隐球菌；血脑屏障；体外模型；致病机制

［Chin J Mycol，2015，10（2）：92⁃95］

新生隐球菌是临床上重要的侵袭性病原真菌，能够有效突破血脑屏障，继而感染中枢神经系统引发致命性脑膜脑炎。阐明隐球菌穿越宿主血脑屏障的机制是预防和治疗隐球菌脑膜脑炎的关键。现有研究认为，隐球菌能够通过外分泌毒力因子的间接作用或者通过分泌多糖分子与脑微血管内皮细胞表面受体直接相互作用，激活内皮细胞骨架调节相关信号通路，进而通过黏附—转胞吞机制穿越血脑屏障［1⁃3］。探寻新生隐球菌相关的毒力因子和宿主脑微血管内皮细胞的关键信号通路，需要能够有效模拟“隐球菌—宿主”相互作用并兼顾可操作性的体外血脑屏障模型的支持。本文探究了基于商品化小鼠脑微血管内皮细胞系的体外血脑屏障模型在隐球菌嗜中枢感染研究中的可行性。

1　材料与方法

1．1材料与试剂

胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM高糖培养基、0．25%胰酶、PBS均购自美国Hyclone公司；谷氨酰胺、非必需氨基酸购自美国Invitrogen公司；0．8 μm PC膜Transwell 24孔板、24孔普通细胞培养板购自美国Corning公司；Ⅰ型鼠尾胶原购自美国Sigma公司。小鼠脑微血管内皮细胞系（bEnd．3）购自美国ATCC；新生隐球菌标准株H99、JEC21以及H99背景的缺陷菌株lac1△、ure1△和cap59△均来源于上海市医学真菌分子生物学重点实验室。Millicell⁃ERS电阻仪购自德国Millipore公司。

1．2构建体外血脑屏障模型

Transwell小室的预处理预铺鼠尾胶原Tran⁃well小室的制备。0．1 mol／L醋酸制备2 mg／mL大鼠鼠尾胶原（Collagen）储存液，于4℃冰箱备用。Transwell小室上室中加入100μL DMEM培养基，于37℃培养箱中孵育2 h。0．01 mol／L醋酸溶液稀释鼠尾胶原储备液，制备140 μg／μL胶原工作液，吸出小室中培养基并加入上述胶原溶液50μL，于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。吸出多余溶液，于超净台中风干，PBS润洗2次，4℃备用。不需铺鼠尾胶原的小室吸出培养基后直接在超净工作台中风干。

内皮细胞接种和跨膜电阻值（Transendothelial Electrical Resistance，TEER）测定Bend．3细胞系生长至单层后，PBS润洗2次，加入0．25%胰酶消化、重悬，离心后完全培养基重悬，血细胞计数板计数并调整细胞悬液浓度至2×105／mL。向制备好的Transwell小室中加入100μL上述细胞悬液，下室中加入600μL完全培养基，于37℃、5%CO2条件下培养，此时记录为D0。

培养第3天（D3）开始监测内皮细胞单层电阻值变化。Millicell⁃ERS电阻仪电极于70%乙醇溶液中浸泡15min，DMEM培养液中润洗后备用。检测方法严格参照仪器说明书。直接检测得到跨膜电阻值Rd，没有接种细胞的小室跨膜电阻值记录为Rm，细胞单层跨膜电阻T＝（Rd⁃Rm）×0．33 cm2（单位：ohm·cm2）。

隐球菌接种和结果测定菌株分别接种于3mL YPD培养基中培养至饱和状态，3 000 r／min，离心3min，PBS清洗，重复2次，完全培养基重悬、计数。调整菌悬液浓度至4×105CFU／mL，4℃备用。实验当天（D1），小心吸出Transwell上室中培养液，加入上述菌悬液100μL，放回培养箱继续培养。

分别于接种隐球菌后3 h、6 h、9 h、24 h取小室下室中液体100μL，涂布YPD平板，立即补充下室中培养液100μL。平板放置30℃孵箱中培养2～3 d后计数菌落数，记为通过体外血脑屏障菌落数估计值C。

1．3建立简化的隐球菌和脑微血管内皮细胞黏附模型（见图1a）

将生长状态良好的Bend．3细胞系消化、重悬，调整细胞悬液浓度至2×105／mL，向24孔细胞培养板中加入细胞悬液1mL，于细胞培养箱中培养约12～16 h至细胞长为致密单层。按照前述方法制备隐球菌悬液，调整浓度至106CFU／mL。向培养板中加入上述菌悬液1mL，放入细胞培养箱中继续培养，分别于接种隐球菌后2 h、4 h，吸出培养板中培养液，PBS小心清洗孔板4次，洗去未结合隐球菌，每孔加入500μL Trition X⁃100，孵育10min，移液器吹打若干次，吸出细胞裂解液，分别转移至灭菌1．5mL离心管中。向孔板中加入500μL PBS，小心吹打后分别转移至上述离心管中。

1．4统计学处理

本文所有数据均以t检验进行统计分析。所有统计学分析以SPSS软件（15．0）完成，以P＜0．05作为衡量是否具有统计学差异的标准。

2　结　果

2．1体外血脑屏障模型的构建与检测

自Transwell上室中接种内皮细胞第2天（D1）开始记录跨内皮细胞电阻TEER值的变化，在接种细胞后的4 d内TEER值增长明显，第5天开始该模型的TEER值逐渐稳定于85 ohms·cm2（见图1b）。预包被鼠尾胶原有利于内皮细胞单层的形成，但处理组与对照组TEER值没有明显差异（P＞0．05）。

2．2不同血清型新生隐球菌穿越血脑屏障效率的评估

利用简化的体外血脑屏障模型检测隐球菌血清A型、D型菌株和酿酒酵母通过血脑屏障能力的变化。模型构建第5天检测TEER值，各组之间没有明显差异（见图2a），第6天每孔接种等量隐球菌悬液，于不同时间点收样检测下室中通过的隐球菌数目。与标准株H99相比，血清型D型标准株JEC21、酿酒酵母Y187通过体外血脑屏障能力显著低于H99（P＜0．05），约为标准株通过率的50%；酿酒酵母突破体外血脑屏障模型的能力最低（见图2b）。

2．3不同毒力因子缺失对新生隐球菌穿越血脑屏障效率的影响

利用简化的体外血脑屏障模型，检测不同毒力因子突变菌株通过血脑屏障效率的变化。模型构建第5天检测TEER值，各组之间没有明显差异（见图3a）。H99，lac1 D，ure1 D，与cap59 D，分别为84．37，83．71，84．04和86．02。第6天每孔接种等量隐球菌悬液，于不同时间点收样检测下室中通过的隐球菌数目。与标准株H99相比，黑色素酶缺陷株lac1△通过体外血脑屏障模型的能力没有显著差异；尿素酶缺陷株ure1△通过体外血脑屏障的能力明显下降（P＜0．001），约为标准株通过率的59．9%；荚膜缺陷株cap59△突破体外血脑屏障模型的能力最低，约为标准株的18%（P＜0．001）（见图3b）。

3　讨　论

新生隐球菌入侵中枢神经系统，必须突破宿主血脑屏障的防御。近年来，对于隐球菌穿越血脑屏障机制的研究取得了一定成果［4］，但是由于体外血脑屏障模型的限制，进展相对缓慢。随着技术的进步，用于体外研究的血脑屏障模型逐渐多样化，可操作性也逐渐提高。基于大鼠、牛、猪、小鼠以及人源性原代脑微血管内皮细胞的单细胞模型和“内皮细胞—星型胶质细胞”共培养模型已经应用于体外药物中枢通透性、嗜中枢病原菌致病机制等多个研究领域［5］。前期对于隐球菌突破血脑屏障防御的研究主要是在人源性脑微血管内皮细胞单细胞培养模型基础上进行的［1⁃3］。研究者应用患者手术切除脑组织中正常组织部分，分离纯化脑微血管内皮细胞接种于Transwell培养板构建体外血脑屏障模型。该模型应用人源的原代细胞，实验数据最接近体内真实情况。然而，其缺陷也是显而易见的：细胞来源珍贵难于获得、传代次数严重受限、原代细胞培养相对困难、模型构建周期长、成本高等等，因而严重制约了其在实际研究工作中应用。

图1　a．体外血脑屏障示意图，b．小鼠bEND．3细胞系的体外血脑屏障模型TEER值变化情况　图2　a．模型构建第5天检测TEER值，各组之间没有明显差异；b．不同血清型隐球菌通过血脑屏障的能力差异　图3　a．模型构建第5天检测TEER值，各组之间没有明显差异；b．ure1△与cap59△通过体外血脑屏障模型能力低于标准株H99Fig．1　C．neoformans crosses the bEND．3cell line，an in vitro model of the BBB　Fig．2　Different serotype of C．neoformans cells crosses BBB model　Fig．3　The contribution of laccase，urase and capsule of C．neoformans cells to BBB crossing was examined

为克服上述模型的一系列缺陷，本研究应用商品化的小鼠脑微血管内皮细胞系bEND．3构建了体外血脑屏障模型，并验证该模型应用于隐球菌突破血脑屏障机制相关研究的可行性。bEND．3细胞系易于获得，模型构建相对简单省时、节约实验成本。根据以往文献报道，选用6．6×104／mL浓度内皮细胞悬液接种于0．4 μm孔径、12孔Transwell小室，正常细胞培养环境下培养，3～4 d即可形成较为完整的细胞单层结构［6］。TEER值是评估细胞屏障模型完整性最准确、最便捷的指标［7］。通过检测接种后不同时间点模型TEER值，我们发现该模型TEER值在接种第5天即达到并稳定于90 ohms ·cm2，稍低于原代内皮细胞模型（～150 ohms· cm2），明显高于以其他内皮细胞系为基础的血脑屏障模型电阻值（～60 ohms·cm2）［8］。通常，为更好地形成完整单层结构，原代细胞为基础的血脑屏障模型必须用Ⅰ型胶原预处理Transwell半通透膜。通过比较TEER值，不难发现胶原预处理对于bEND．3为基础的血脑屏障模型没有明显影响，两组均能获得较高的电阻值。因而，该模型的构建可以省去胶原纯化、处理的繁杂步骤，节约模型构建时间和成本。

通过检测模型比较新生隐球菌不同血清型标准株：A血清型标准株H99和D血清型标准株JEC21通过bEND．3细胞屏障能力的差异，同时以非致病性的酿酒酵母作为阴性对照，我们发现，新生隐球菌不同血清型菌株通过该体外血脑屏障的能力不同。A血清菌株对体外血脑屏障的侵袭能力强于D血清型（P＜0．05）。酿酒酵母几乎不能通过bEND．3构建的体外血脑屏障模型，进一步说明该模型能够较好地模拟体内血脑屏障功能。既往研究证实血清型A致病力和毒力高于血清型D型，而血清型A配型α标准株H99致病力最强［9⁃11］。而我们实验中发现血清D型通过血脑屏障模型的能力更弱，这可能是其致病力较血清A型菌株更弱的重要原因之一。

已知隐球菌有多种毒力因子在中枢感染过程中发挥重要作用，如荚膜、尿素酶、细胞壁多糖（透明质酸）等。荚膜是隐球菌最具特征性、最重要的毒力因子，并且可能直接参与隐球菌突破血脑屏障的过程［12］。尿素酶缺陷菌株ure1△中枢感染能力减弱，应用尿素酶抑制剂也能有效抑制隐球菌中枢感染，但尚缺少体外实验证据支持［13］。利用bEND．3构建的体外血脑屏障模型，我们也证实了荚膜、尿素酶在隐球菌突破血脑屏障的过程中发挥重要作用，而黑色素酶作用有限。荚膜缺陷株cap59△突破体外血脑屏障的能力较背景菌株H99下降了约82%，与其他体外血脑屏障模型得到的结论一致［1］。尿素酶缺陷株ure1△下降了约40%，与体内实验证据吻合。

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［本文编辑］卫凤莲

Construction and application of blood⁃brain⁃barrier model in vitro in cryptococcal infection

MENG Yun⁃fang，FA Zhen⁃zong，FANG Wei，ZHOU Zhao⁃jing，YI Jiu，GU Ju⁃lin，LIAO Wan⁃qing
（Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology，Shanghai Institute of Medical Mycology，Department of Dermatology and Venereology，Changzheng Hospital，Shanghai 200003，China）

ObjectiveTo establish an in vitro Blood⁃Brain⁃Barrier（BBB）model，which was then applied to evaluate the capaci⁃ties of different cryptococcal strains in crossing Blood⁃Brain⁃Barrier．MethodsMouse brain endothelium cell bEND．3 was used to construct the Blood⁃Brain⁃Barrier model in vitro．In order to test its feasibility，we next examined the efficacy of several cryptococcal strains with different serotype or gene mutation in central nervous system（CNS）invasion．ResultsThe transendothelial electrical resistance（TEER）measurement suggested that BBB model was constructed successfully．Compared with C．neoformans serotype A strain H99，JEC21（C．neoformans serotype D）displayed a reduced efficacy in BBB invasion while the negative control strain（non pathogenic Saccharomyces cerevisiae strain Y187）with the lowest efficacy．Furthermore，the ure1△mutant（urease deletion）and the cap59△mutant（capsule deletion）showed a 50%and 80%decrease of their efficacy in crossing BBB compared to their parent strain H99，respectively（P＜0．001）．ConclusionThe in vitro model of cryptococcal CNS infection was established successfully．Se⁃rotype，urease，and capsule was essential for C．neoformans to cross the Blood⁃Brain⁃Barrier．

Cryptococcus neoformans；Blood⁃Brain⁃Barrier；in vitro model；pathogenesis

Q 95⁃33R 379．5

A

1673⁃3827（2015）10⁃0092⁃04

国家973项目（2013CB531601，2013CB531604）；国家自然科学基金（81271799，31170139）；上海市医学真菌分子生物学实验室基金（14DZ2272900）

孟云芳，女（汉族），博士研究生在读．E⁃mail：mengyun⁃fang6．12＠163．com；法振宗，男（汉族），博士研究生在读．E⁃mail：fazhenzong＠163．com

廖万清，E⁃mail：liaowanqing＠sohu．com；顾菊林，E⁃mail：wujgjl＠126．com

2015⁃01⁃22