氟喹诺酮类制剂中非法添加对乙酰氨基酚和安乃近的测定方法研究

2015-08-08董玲玲郝利华万仁玲

中国兽医杂志 2015年8期

董玲玲，杨星，范强，郝利华，万仁玲

（中国兽医药品监察所，北京海淀 100081）

氟喹诺酮类药物因能通过干扰DNA、RNA及蛋白质的合成而起杀菌作用，而被广泛使用。但一些不法生产企业为提高产品疗效而非法添加处方外药物。目前，根据监督抽检中发现的问题，有添加解热镇痛类药物的现象。参考已建立的一些非法添加检查方法[1-2]，本研究以薄层色谱法进行初筛，以高效液相色谱方法进行确证，建立了氟喹诺酮类制剂中非法添加对乙酰氨基酚和安乃近的检查方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂高效液相色谱仪（Waters 2695，PDA，Empower2色谱工作站软件）；分析天平（十万分之一）；磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯；甲醇为色谱纯。

1.2 试药对乙酰氨基酚：（批号：10116942，Al⁃faAesar）；安乃近：（批号：950811，南通制药厂）。阴性供试品：恩诺沙星、烟酸诺氟沙星、氧氟沙星、盐酸环丙沙星可溶性粉及注射液；供试品：恩诺沙星可溶性粉（按1%添加安乃近）、乳酸环丙沙星注射液。氟喹诺酮类对照品均来自中国兽医药品监察所。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱方法

2.1.1 检验方法取供试品1.0 g或1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理5 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取对乙酰氨基酚和安乃近对照品，分别加甲醇制成每1 mL中含对乙酰胺氨基酚或安乃近1 mg的溶液，作为对照品溶液。取上述溶液各5μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视：氟喹诺酮类药物在原点显蓝色荧光斑点，阴性供试品色谱中，在与对照品相应位置未显示与对照品相同颜色的荧光斑点，无干扰。供试品色谱中，在对照品色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。

图1 薄层色谱结果

2.1.2 薄层色谱检测限取对乙酰氨基酚对照品，分别加甲醇制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，取0.5、1、2、5、10、20 μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，在上述薄层色谱条件下，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，结果显示，点样体积为1μL时，斑点基本可见，故确定在该薄层色谱条件下对乙酰氨基酚检测限为0.1μg。另取安乃近对照品同法操作，结果显示，点样体积为2μL时，斑点基本可见，故确定安乃近检测限为0.2μg。

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 mL，用氢氧化钠饱和溶液调节pH值至7.0）为流动相A，甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱；二极管阵列检测器，采集波长范围为200 nm～400 nm，分辨率为1.2 nm；记录244 nm波长处的色谱图。对乙酰氨基酚、安乃近、4-甲基安替比林（MAA）与氟喹诺酮类药物的分离度应大于1.5。

2.2.2 溶液配制

表1 流动相梯度洗脱表

2.2.2.1 供试品溶液和对照品溶液取供试品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇适量超声5 min后，用甲醇稀释至刻度，摇匀；量取1.0 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取对乙酰氨基酚、安乃近对照品适量，分别加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2.2 氟喹诺酮类制剂空白溶液取阴性供试品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声5 min，加甲醇至刻度；取1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

图2 系统适用性色谱光谱

2.2.3 测定法取上述各溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图与光谱图。

2.2.4 峰纯度检查对供试品溶液色谱图中对乙酰氨基酚、安乃近色谱峰进行峰纯度检查，结果显示，对乙酰氨基酚峰与安乃近峰的纯度角度均小于纯度阈值，表明在此液相条件下，对乙酰氨基酚峰与安乃近的出峰处无其他干扰峰，为单一物质峰，方法可行。

2.2.5 光谱相似度检查对供试品溶液中对乙酰氨基酚峰、安乃近峰的光谱图与对照品的进行匹配，匹配角度均小于匹配阈值，表明供试品溶液中相应色谱峰的光谱与对乙酰氨基酚、安乃近对照品的光谱非常相似，可认为是同一物质。

图3 供试品色谱光谱图1

图4 供试品色谱光谱图2

2.2.6 检出限取阴性供试品2.0 g或2.0 mL，置50 mL量瓶中，加1 mg/mL的对乙酰氨基酚溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL或5 mg/mL的安乃近储备液 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，加甲醇至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置25 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。以光谱图失真的最大浓度作为方法的检出限，对乙酰氨基酚检出限为0.5μg/g（mL），安乃近检出限为5 μg/g（mL）。

2.2.7 回收率试验取阴性供试品2.0 g或2.0 mL，精密加对乙酰氨基酚对照品适量，按2.2.2.1法制备回收率试验溶液，平行配制6份。立即测定并计算，对乙酰氨基酚平均回收率为101.2%，RSD为0.5%；另取安乃近对照品及氟喹诺酮类可溶性粉，同法操作，安乃近平均回收率为101.0%，RSD为0.5%。

2.2.8 耐用性从柱温、流动相pH值、色谱柱3个方面考察方法的耐用性。调节柱温为20℃、25℃和30℃，随柱温升高，保留时间略提前，但差异小于0.2 min；调节流动相pH值为6.8、7.0和7.2，保留时间几乎不变；选择4款不同品牌、填料的色谱柱进行考察，分离度均大于1.5，结果显示方法耐用性较好。

3 讨论

按《中国兽药典》2010年版一部对某企业乳酸环丙沙星注射液进行检验时发现，在液相色谱图中除环丙沙星色谱峰外还有一异常峰，根据光谱图形状及最大吸收，怀疑可能为解热镇痛类药物峰。通过薄层色谱法与对乙酰氨基酚、安乃近对照品斑点进行比对，怀疑可能掺入了对乙酰氨基酚，并通过高效液相色谱法（PDA法）进行了确证。

安乃近遇水迅速水解成活性代谢物4-甲氨基安替比林（MAA）[3]，故选择纯甲醇作为溶媒。而氟喹诺酮类注射剂均为水溶液，在进行回收率试验时，色谱图中会出现MAA色谱峰，且随着样品放置时间的延长，MAA峰面积会增大。此时，以安乃近与MAA峰面积之和计算，平均回收率为101.0%，RSD为0.7%，与未产生MAA色谱峰的安乃近平均回收率结果一致。故当氟喹诺酮类注射液中掺入安乃近时，仅以安乃近色谱峰计算会使结果偏低，故应考虑以安乃近与MAA峰面积之和计算安乃近的掺入量。