犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

熊 炜，张 强，王 艳，陈政晓，蒋 静，王巧全，陈 沁，李 健

（1.上海出入境检验检疫局，上海 浦东 200135；2.上海大学生命科学学院，上海 宝山 200444）

犬冠状病毒病是一种以胃肠炎为主要症状的高度接触性传染病，它由犬冠状病毒（Canine coro⁃navirus，CCV）引起，临床上以犬严重脱水、呕吐、腹泻和血便为主要特征，致死率较低，但与其他传染病混合感染时，死亡率提高，对幼犬危害严重。目前，世界很多国家均已发现本病，是对养犬业危害较大的疫病之一。犬的健康与否与人类健康密切相关，以CCV为代表的冠状病毒极易变异，导致冠状病毒血清型众多，且新的血清型还在不断出现，为CCV的诊断和免疫预防带来了更大的困难[1-2]。从1996年首次报道分离出CCV以来，国内学者对CCV的诊断方法和CCV主要蛋白的编码基因进行了广泛的研究，已报道的主要检测方法有病毒分离、RT-PCR和核酸探针检测等[2-5]，已报道的CCV功能基因的克隆和序列分析主要有TN449株的M基因、V1株的膜蛋白基因、部分S基因等[6-9]。本研究对CCV TN449株的核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N）基因编码序列进行克隆和表达，并将表达的CCV N蛋白包被ELI⁃SA反应板，建立了CCV血清间接ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株及阳性和阴性血清 CCV TN449株（ATCC编号：VR-989），由美国菌种保藏中心引进并保存。将该病毒在狗直肠瘤细胞系（A72）上扩增，取细胞裂解液备用。犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬传染性肝炎病毒（ICHV）、伪狂犬病病毒（PRV）和犬布鲁菌（CB）的阳性血清由本室保存。

1.2 主要试剂 TRIZol、逆转录酶，购自Invitrogen公司；Taq酶，购自Stratagene公司；RNA酶抑制剂、dNTP、DNA Marker、蛋白Marker、T4 DNA连接酶，购自TaKaRa公司；限制性内切酶BamH I和Not I，购自NEB公司；大肠杆菌感受态细胞（Top 10F和BL 21）、质粒抽取试剂盒、胶回收试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgG、TMB试剂，均购自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白表达产物纯化采用GE公司HisTrap HP亲和柱。

1.3 引物设计 参照GenBank中登录的CCV TN449株的N基因序列（EF056485）设计引物，其上游引物（CCVNF）为：5′-CGGGGGCCAACCAGGGA CAACGCGTTAG-3′（BamH I），下游引物（CCVNR）为：5′-CCGGTTCGTTACCTCATCAATAATCTC-3′（Not I），扩增N基因大小为1149 bp。

1.4 RNA抽提和目的基因扩增 取200μL细胞裂解液进行RNA抽提，经反转录合成cDNA，采用PCR扩增目的基因。

1.5 目的基因和质粒载体的连接 PCR产物和质粒载体经BamH I和Not I酶切，并经胶回收纯化后，使用T4 DNA连接酶进行连接，并转化Top 10F大肠杆菌感受态细胞。

1.6 表达产物的SDS-PAGE电泳和Western Blot检测 将IPTG诱导的重组菌样品进行SDS-PAGE电泳，检测重组蛋白的表达。将表达的重组蛋白利用HisTrap HP亲和柱纯化后，进行蛋白电泳，并将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，再使用CCV阳性血清和用辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgG作为二抗，对重组蛋白进行Western Blot鉴定。

1.7 抗原包被最佳浓度与血清最佳稀释度的确定 采用方阵试验测定。取纯化CCV N蛋白（浓度4.0 μg/mL），用磷酸盐缓冲包被液，按1∶2～1∶128进行稀释，包被ELISA板，4℃过夜；用PBST洗涤后，加入40 g/L PEG20000，37℃封闭2 h；用PBST洗涤后，将CCV阳性和阴性血清按1∶100～1∶800倍比稀释后，加入酶标板，37℃作用l h；用PBST洗涤后，加入1∶1000稀释的羊抗犬HRPIgG，37℃作用1 h；用PBST洗涤后，加TMB显色液，37℃作用15 min；最后加入H2SO4终止反应，读取OD450nm值。以阳性血清OD450nm值接近1.0，P/N值（阳性血清OD450nm/阴性血清OD450nm）≥2.0的抗原最大稀释度作为抗原最适工作浓度，其相应的血清稀释度为最佳血清稀释度。

1.8 间接ELISA阴阳性临界值的确定 采用建立的间接ELISA方法对本室保存的126份犬CCV阴性血清样本进行检测。每份样品重复3孔，结果取平均值，计算样本OD450nm的平均值(-X)和标准差（SD）。根据统计学，样本OD450nm值＞阴性样本OD450nm值+2SD时，判定为阳性。

1.9 敏感性试验 将CCV阴性和阳性血清做1∶50～1∶12800倍比稀释后，用建立的间接ELISA方法进行检测。

1.10 特异性试验 用建立的CCV间接ELISA方法分别检测CDV、CPV、CPIV、ICHV、PRV和CB的阳性血清，以验证建立的间接ELISA方法是否对其他犬传染病的阳性血清具有交叉反应性。

1.11 临床样品的复检试验 使用建立的CCV间接ELISA方法对本室保存的36份CCV阳性犬血清和14份CCV阴性犬血清进行复测，以验证建立的间接ELISA方法的稳定性和可靠性。

2 结果

2.1 目的基因的RT-PCR扩增 将CCV TN449株在A72细胞上扩增，后提取细胞培养物中的RNA，采用RT-PCR对CCV的N基因进行扩增。结果显示，扩增的目的片段约1200 bp，与预期结果（1166 bp）（图1）。

图1 RT-PCR扩增CCV N基因

2.2 目的基因的克隆及产物的酶切鉴定 将PCR产物胶回收后，与质粒载体连接，转化感受态细胞，经平板筛选和酶切鉴定后，证实目的基因已重组入表达质粒（图2）。经测序，质粒中目的基因与报道的TN449株N基因（EF05648）同源性为98.6%。

图2 CCV的N基因重组质粒酶切鉴定

2.3 目的基因的表达及抗原性鉴定 将pETCCV-N1/BL 21重组菌进行6 h诱导表达，表达产物经SDS-PAGE进行分析。结果显示，与空载体对照及未经IPTG诱导目的基因克隆菌的蛋白电泳图相比，阳性克隆菌经IPTG诱导后，其电泳蛋白谱中出现了分子量大小为45 ku的目的基因表达产物（图3）。将表达的目的蛋白产物经SDSPAGE电泳、转膜，并使用CCV阳性血清进行Western-Blot分析，证实电泳蛋白谱中出现的45 ku的蛋白具有CCV蛋白的反应原性（图4）。

图3 CCV N基因表达产物的SDS-PAGE电泳图

2.4 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定 经方阵试验测定，建立的CCV间接ELISA检测方法中，当CCV阳性血清为l∶100稀释、CCV N蛋白抗原的最佳包被浓度为1.0μg/mL（稀释倍数1∶4）时，阳性血清的OD值接近于1.0，而阴性血清的OD值较低，分布于0.05～0.2之间，P/N值≥5.0。因此，确定CCV阳性血清的最佳工作浓度为1∶100，相应的CCV N蛋白抗原的最佳包被浓度为1.0μg/mL。

图4 重组CCV N蛋白纯化产物的Western-Blot分析

2.5 间接ELISA阴阳性临界值的确定 在确定抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的基础上，采用建立的间接ELISA方法对本室收集和保存的126份犬CCV阴性血清样本进行检测。结果显示，这些血清的OD450值介于0.392至0.052间，其平均值为0.298，标准差SD为0.060，根据阴阳性临界值=+2SD得出该阴阳性临界值为0.418。因此，当待测样品的OD450nm值≥0.418时为阳性，而OD450nm值＜0.418时为阴性。

2.6 间接ELISA敏感性试验 将纯化的CCV N蛋白抗原按最佳浓度和条件包被96孔板，再将CCV阴性和阳性血清分别做1∶50～1∶12800倍比稀释后，加入96孔板进行间接ELISA检测。结果显示，CCV阳性血清1∶6400稀释后仍检测呈阳性，而经1∶12800稀释后检测呈阴性。

表1 间接ELISA敏感性试验结果

2.7 间接ELISA特异性试验 用建立的CCV间接ELISA方法对CCV、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、伪狂犬病病毒和犬布鲁菌的阳性血清进行检测。结果显示，CCV阳性血清OD450值＞1.0，而其他病毒和细菌感染阳性动物的血清OD450nm值均＜0.418呈阴性，表明建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。

2.8 临床样品的复检试验 使用建立的CCV间接ELISA方法对本室保存的36份CCV阳性犬血清和14份CCV阴性犬血清进行复检。结果显示，36份CCV阳性血清经间接ELISA检测均呈阳性，而所有阴性血清经复检均呈阴性，阴阳性符合率为100%。

3 讨论

2004年肆虐全球的“非典”（Severe acute respi⁃ratory syndrome，SARS）是由一种新型冠状病毒引起，它在世界上30多个国家不同程度的流行，导致了巨大的经济损失。SARS病毒和CCV均来源于物种相近的犬猫科动物，加强对CCV的研究和检测意义重大。本研究以美国ATCC引进的CCV参考毒株TN449株为对象，对其N蛋白编码基因进行克隆和表达，并证实该体外表达和纯化的N蛋白具有良好的抗原反应性；在获取纯化重组N蛋白基础上，在其包被于ELISA反应板，建立了CCV抗体间接ELISA检测方法，并确定了重组蛋白的最佳包被浓度、待检血清的最佳浓度和阴阳性判定的临界值。进一步将该间接ELISA方法用于多种常见犬病阳性血清的检测，证实该方法具有良好的特异性；将该方法用于2006年至2012年本室收集并保存的36份CCV阳性血清和14份阴性血清的复检，证实建立的间接ELISA方法具有良好的稳定性和可靠性，其阴阳性结果符合率为100%。

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