洛伐他汀对醛固酮诱导体外新生大鼠心肌成纤维细胞NO的调控

冯惠平，贾新未，王艳飞，张 芳，张兰芳，解俊敏

(河北大学 附属医院 心内科，河北 保定071000)

心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖在心肌纤维化中起重要作用。已有报道CFs 具有诱导型一氧化氮合酶——一氧化氮(iNOS-NO)系统，其合成的NO是一种重要的抗心肌纤维化因子[1]。他汀类药物对醛固酮诱导的CFs的iNOS-NO 系统活性是否有调控作用?尚未见报道。本文实验观察了洛伐他汀干预条件下大鼠CFs的iNOS-NO 系统活性的变化，为心肌纤维化的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:出生2～3 d的清洁级SD大鼠18只，雌性10只，雄性8只，河北医科大学动物中心，合格证号804010。

1.1.2 试剂:洛伐他汀、醛固酮、四氮唑盐(MTT)和胰蛋白酶(Sigma 公司);DMEM 培养基(Gibco 公司);NO 和iNOS测定试剂盒(南京建成生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFs的培养和鉴定:在无菌条件下取大鼠的心室，采用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法分离CFs。待CFs 生长接近汇合时以1∶3 传代。对CFs 进行SABC 法免疫组织化学染色波形蛋白、纤维连接蛋白染色阳性和平滑肌肌动蛋白染色阴性鉴定为所需的CFs，纯度达98%。实验用2～3代细胞。

1.2.2 实验分组:分为对照组、不同浓度的洛伐他汀组(1×10－5、1×10－6、1×10－7和1×10－8)和醛固酮(1×10－7mol/L)组，细胞取自同批培养的CFs。

1.2.3 MTT 比色法检测细胞增殖:将对数增殖期CFs 接种在96孔板中，每孔5×103个细胞，在3℃、50 ml/L CO2及饱和湿度下培养;24 h后换含1%血清DMEM 培养液，继续孵育24 h，使细胞进入生长静止期。弃上清液，分别加入各种干扰因素继续培养48 h，每组设6个复孔。于培养结束前4 h，加入MTT(5 g/L)20 μL，在酶标仪上490 nm 波长处测定吸光度值(A490值)。

1.2.4 iNOS-NO 系统活性测定:

1)细胞培养液NO含量和iNOS的活力测定:CFs 培养至近汇合状态时，1%血清DMEM 培养液驯化24 h，分别加入培养液和药物，孵育24 h，收集细胞培养液。采用硝酸还原酶法检测细胞培养液中的NO含量，采用分光光度计法测定iNOS 活性。

2)Western blot 分析iNOS 蛋白表达:将2～3代的CFs种植于50 mL 培养瓶中增殖至亚汇合状态后，在含1%胎牛血清DMEM 培养液中培养24 h，然后加入不同浓度的洛伐他汀作用24 h后观察iNOS 蛋白表达。用SDS 缓冲液溶解并粉碎细胞，95℃加热5 min 使蛋白质变性，离心取蛋白质上清液20 μL。用10% SDS 聚丙烯酰胺电泳分离蛋白，电转仪转移到硝酸纤维素膜(100 V，1.5 h)。5%脱脂奶粉4℃过夜封闭非特异结合部位，兔抗大鼠iNOS 多克隆抗体(1∶100)室温孵育2 h，HRP 连接的二抗(1∶2 000)孵育2 h，DAB 显色。采用Gel-pro 凝胶分析软件成像分析系统软件对Western 印迹结果进行定量分析，吸光度值以积分光密度值(A)表示。

2 结果

2.1 洛伐他汀对CFs增殖的影响:在1×10－7、1×10－6和1×10－5mol/L洛伐他汀的作用下，A值分别为0.356±0.011、0.287±0.008 和0.231±0.007，随着洛伐他汀浓度的增加呈递减趋势。1×10－8mol/L 洛伐他汀组的A490值与1×10－7mol/L 醛固酮组A490值比较差异无显著性。

2.2 洛伐他汀对醛固酮诱导CFs的NO含量和iNOS 活性的影响:以1×10－7mol/L 醛固酮诱导CFs 24 h 为对照组，(1×10－8－1×10－5)mol/L 洛伐他汀剂量依赖性增加CFs的NO含量和iNOS 活性(P＜0.01)(表1)。

表1 不同浓度洛伐他汀对醛固酮诱导CFs的NO含量和iNOS 活性的影响Table1 Effects of various concentration of lovastatin on NO contents and iNOS activity of CFs induced by aldosterone (n=6)

2.3 洛伐他汀对醛固酮诱导CFs iNOS 蛋白表达的影响:以空白对照组的吸光度扫描结果为100，1×10－7mol/L 醛固酮组吸光度扫描结果为33.37±4.14，洛伐他汀组吸光度扫描结果分别为52.73±4.04(1×10－8mol/L)，80.87±3.50(1×10－7mol/L)，121.13±6.90(1×10－6mol/L)，176.47±6.50 (1×10－5mol/L)。在1×10－8～1×10－5mol/L浓度范围内，洛伐他汀剂量依赖性地升高CFs的iNOS 蛋白表达(图1)。

2.4 相关性分析:(1×10－8～1×10－5)mol/L 洛伐他汀和1×10－7mol/L醛固酮共同作用CFs 24 h后，CFs的NO 生成量与iNOS 活性、iNOS 活性与iNOS 蛋白表达均呈显著正相关，r分别为0.826、0.896，P＜0.01。NO 生成量与A490值成显著负相关(r= －0.908，P＜0.01)。

图1 洛伐他汀对醛固酮诱导CFs iNOS 蛋白表达的影响Fig1 Western blot analysis of Lovastatin on iNOS protein expression in CFs induced by aldosterone

3 讨论

CFs增殖和胶原合成积聚过多是心肌纤维化的主要病理基础。CFs 合成的NO是一种重要的抗心肌纤维化因子，可通过自分泌和(或)旁分泌的途径抑制CFs增生和胶原合成，NO 能够降低体外培养CFs 纤维连接蛋白，I型和III型胶原蛋白mRNA表达和纤维连接蛋白合成，延缓心肌纤维化发展[2]。本研究表明CFs 具有内源性iNOS-NO 系统，能够生成NO，与参考文献[1]研究结果一致。

他汀类药物的非降脂作用日益受到瞩目，除良好的调节脂代谢作用以外，他汀类药物尚具有改善血管内皮细胞功能、抑制血管平滑肌细胞增殖，稳定斑块，减少心肌梗死和脑卒中等心脑血管事件的发生。最近有研究表明，瑞舒伐他汀能减缓并抑制狗的心肌肥厚，改善左室功能[3]。本研究已证实他汀类药物可抑制醛固酮促CFs增殖的作用，在1×10－8～1×10－5mol/L浓度范围内，洛伐他汀可抑制醛固酮作用增加CFs的NO含量、iNOS 活性、iNOS 蛋白表达。

醛固酮下调CFs的iNOS-NO 系统活性致CFs增殖，而洛伐他汀上调醛固酮诱导的CFs的iNOS-NO 系统的活性，拮抗醛固酮的促心肌纤维化作用。CFs的iNOS-NO 系统活性的变化参与了他汀类药物抑制醛固酮促心肌纤维化作用。

[1]Gustafsson AB，Brunton LL.Beta-adrenergic stimulation of rat cardiac fibroblasts enhances induction of nitric-oxide synthase by interleukin-1beta via message stabilization[J].Mol Pharmacol，2000，58:1470-1478.

[2]Chun TY，Bloem LJ，Pratt JH.Aldosterone inhibits inducible nitric oxide synthase in neonatal rat cardiomyocytes[J].Endocrinology，2003，144:1712-1717.

[3]Zacà V，Mishra S，Gupta RC，et al.Pleiotropic effects of long-term monotherapy with rosuvastatin in dogs with moderate heart failure[J].Cardiology，2012 123:160-167.