睾酮抑制小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞形成

周 炜，刘 玮，廖 华，陈曼华

(武汉市中心医院1.心内科;2.中心实验室;3.老年科，湖北 武汉430014)

生理浓度的睾酮具有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)作用[1]，但其分子机制尚不清楚。巨噬细胞迁入内膜下吞噬脂质转变为泡沫细胞是AS 早期的标志性事件。本文旨在观察睾酮对泡沫细胞形成的作用，以及对相关蛋白表达的影响，探讨睾酮抗AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料:小鼠巨噬细胞系RAW264.7(中科院上海细胞生物所);氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(尚善生物);细胞胆固醇检测试剂盒(普利莱公司);蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司);睾酮、油红O(Sigma 公司);抗线粒体融合素2(Mfn2)抗体(Abcam 公司)，抗CD36，ATP 结合盒转运蛋白A1(ABCA1)及β-actin 抗体，辣根过氧化物酶标记的IgG(CST)。

1.2 细胞培养与实验分组:细胞接种于培养皿中，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，在37℃，5% CO2细胞培养箱中培养。分组如下:对照组(control)不加干预因素;泡沫细胞组(Foam cells)加入50 μg/mL ox-LDL 孵育48 h;不同浓度睾酮组(Testosterone，T):分别加入5×10－9、5×10－8及5×10－7mol/L 睾酮预处理24 h，PBS 缓冲液洗脱，后续步骤同泡沫细胞组。

1.3 油红O 染色:按参考文献[2]的方法操作。

1.4 细胞胆固醇测定:按试剂盒说明操作，检测细胞内胆固醇浓度，分别与蛋白浓度做出比值后，比较组间相对胆固醇浓度。包括总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯(总胆固醇－游离胆固醇)。

1.5 免疫印迹法检测蛋白表达:按参考文献[2]的方法操作，检测目的蛋白/β-actin 吸光度比值。

2 结果

2.1 细胞内脂质含量:巨噬细胞与ox-LDL 孵育后，胞质内见大量红色脂滴，细胞内胆固醇含量增加(P＜0.05)。预先行睾酮干预后，细胞内脂滴含量减少，胆固醇含量降低(P＜0.05)(图1)。

2.2 目的蛋白的表达:与对照组比较，ox-LDL 刺激下巨噬细胞内Mfn2表达降低，CD36和ABCA1表达增高(P＜0.05);与泡沫细胞组比较，预先行睾酮干预后，Mfn2表达增加，CD36表达降低，ABCA1表达增高(P＜0.05)，呈一定浓度依赖性(图2)。

图1 睾酮对细胞胆固醇含量的影响Fig1 Effects of testosterone on the cholesterol in cells(±s，n=3)

图2 睾酮对蛋白表达的影响Fig2 Effects of testosterone on the protein expression in cells (±s，n=3)

3 讨论

本研究中，ox-LDL 刺激下巨噬细胞泡沫化，清道夫受体CD36和胆固醇外排蛋白ABCA1表达均增加。其中，ABCA1表达增加可能反映细胞对脂质负载的自身调节，提示在ox-LDL 诱导下巨噬细胞摄取及逆向转运脂质均增加，而脂质摄取增多大于外排的作用，从而转变为泡沫细胞。而预先给予不同浓度睾酮干预可呈浓度依赖性减少胆固醇在巨噬细胞内的蓄积，抑制其向泡沫细胞转化，同时CD36表达降低，ABCA1表达增加。据此认为，睾酮可抑制巨噬细胞转化为泡沫细胞，其作用与下调CD36 减少胆固醇摄取和上调ABCA1 增加胆固醇外排有关。

Mfn2是一种线粒体外膜蛋白，对线粒体融合、线粒体形态及功能的调节有重要作用，Mfn2 也是细胞信号传导通路中一个重要的调控点[2]。前期研究发现，Mfn2是原癌基因ras的直接负调控因子，可抑制磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 和丝裂原活化蛋白激酶信号通路，抑制清道夫受体CD36，促进ABCA1表达，抑制巨噬细胞转化为泡沫细胞[3]。这表明Mfn2是调控泡沫细胞形成及AS 发生与发展的重要基因，但对于Mfn2的上游调节方式尚无报道。本实验中发现，睾酮呈浓度依赖性上调Mfn2表达。这提示睾酮作为内源性生物活性物质，可能通过上调Mfn2表达，影响下游胆固醇转运相关蛋白CD36和ABCA1的表达，进而调节巨噬细胞对胆固醇的摄取和外排，从而发挥其抑制泡沫细胞形成的作用。

[1]Kelly DM，Jones TH.Testosterone:a vascular hormone in health and disease[J].J Endocrinol.2013，217:47-71.

[2]Liu C，Ge B，He C，et al.Mitofusin 2 decreases intracellular lipids in macrophages by regulating peroxisome proliferator-activated receptor-γ[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，450:500-506.

[3]Chen KH，Dasgupta A，Ding J，et al.Role of mitofusin 2(Mfn2)in controlling cellular proliferation[J].FASEB J.2014，28:382-394.