曲美他嗪和/或瑞舒伐他汀改善心肌梗死大鼠的心功能损伤

谭力力，刘丽敏，李 潞，赵红丽

(沈阳医学院 沈洲医院 1.心血管一科， 辽宁 沈阳 110035； 2.干诊二科， 辽宁 沈阳 110000)



研究论文

曲美他嗪和/或瑞舒伐他汀改善心肌梗死大鼠的心功能损伤

谭力力1，刘丽敏2*，李 潞1，赵红丽1

(沈阳医学院 沈洲医院 1.心血管一科， 辽宁 沈阳 110035； 2.干诊二科， 辽宁 沈阳 110000)

目的探讨曲美他嗪和瑞舒伐他汀对心肌梗死(MI)的心脏保护作用。方法结扎左冠状动脉前降支建立大鼠MI模型。大鼠分为假手术组、MI组、曲美他嗪+MI组、瑞舒伐他汀+MI组、联合用药+MI组。MI之后每天给予药物治疗14 d。测定血流动力学参数。TUNEL染色检测凋亡指数。Evans/TTC双染色测定心肌梗死面积。Western blot测定Bcl-2和Bax表达。结果与假手术比较，MI大鼠LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均显著降低(P<0.01)，LVEDP显著性升高(P<0.01)。与MI组比较，曲美他嗪+ MI组、瑞舒伐他汀+ MI组和联合用药+ MI组的LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均显著增加，LVEDP呈显著性下降(P<0.05)。假手术组心肌中未见明显心肌细胞凋亡。MI组心肌细胞凋亡指数显著上升，且Bcl-2和Bax表达也有显著增加，以Bax表达增加为主。药物干预后，与MI组相比，心肌细胞凋亡显著下降，Bcl-2与Bax表达均明显下降，以Bax下降为主(P<0.05)，上述变化以联合用药组+ MI最明显。结论心肌梗死后曲美他嗪和瑞舒伐他汀治疗可以改善心功能，可能与抑制心肌细胞凋亡、调节Bax和Bcl-2表达有关。两者联合给药疗效更佳。

心肌梗死；凋亡；曲美他嗪；瑞舒伐他汀

心肌梗死指由于动脉粥样硬化斑块形成或冠状动脉痉挛等导致心肌血供下降，最终导致心肌细胞死亡的过程，是临床心内科常见病、多发病。

他汀类药物又称为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A(HMG-COA)还原酶抑制剂。HMG-COA 还原酶是胆固醇合成代谢中的关键限速酶，瑞舒伐他汀可竞争性抑制该酶的作用，使胆固醇合成减少，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)清除增加，并有降三酰甘油作用[1]。他汀类药物目前已经成为心梗患者治疗的常用药。曲美他嗪是第一个临床用于治疗冠心病的代谢药物，具有抗缺血和抗心绞痛作用[2]。

本实验通过建立大鼠心肌IPC模型，观察心肌IPC对梗死面积及凋亡相关基因Bcl-2/Bax表达的影响，以及曲美他嗪和瑞舒伐他汀对细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雄性SD大鼠，体质量200 g，3～4月龄[北京维通丽华实验动物有限公司，合格证编号SCXK(京2012-0001)]。曲美他嗪[施维雅(天津)制药有限公司]；瑞舒伐他汀(阿斯利康制药有限公司)；Bax 试剂盒、Bcl-2试剂盒和TUNEL试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠模型的建立及实验分组：大鼠随机分为3组：假手术组、MI组、MI+曲美他嗪(T)组、MI+瑞舒伐他汀(R)组和MI+T+R组，每组10只。假手术组大鼠行开胸术，分离冠状动脉但不阻断。MI组大鼠同时行冠状动脉结扎。MI+T组和MI+R组分别每天给予曲美他嗪20和10 mg/kg瑞舒伐他汀；MI+T+R组剂量减半，灌胃给药，共14 d。

1.2.2 MI模型的建立：常规方法建立MI模型。

1.2.3 血流动力学参数的测定：常规记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(dP/dTmax)及左室内压最大下降速率(dP/dTmin)。

1.2.4 心肌缺血面积及梗死面积测定：采用Evans/TTC双染色法。切片显示3种颜色，钻红色为正常心肌，蓝色为梗死危险区心肌，灰白色为梗死心肌。实验结束后，原位结扎冠状动脉，80 mmHg压力下经主动脉逆行灌注1%的伊文思蓝 (2～3 mL)。摘除大血管、心房及右心室，沿左心室长轴横切心室为6～8片(厚约2mm)，然后仔细分离非缺血区和缺血区。将缺血区置于1% TTC磷酸缓冲液中，于37℃孵育15 min，此时坏死区呈灰白色，以此将坏死区从缺血区中分离，心肌梗死面积以坏死区心肌重量/缺血区心肌重量(AN/AAR)表示。

1.2.5 心肌细胞凋亡指数(apoptotoc index,AI)：取适量全层心肌组织，按常规病理组织学方法制备心肌石蜡标本，采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)检测凋亡心肌细胞，按说明书操作。细胞系呈棕褐色或棕黄色颗粒且具备凋亡细胞形态学特征判定为凋亡细胞。光镜下根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片拍摄5个阳性视野，每视野计数300个心肌细胞中的凋亡阳性细胞数，以阳性细胞数所占观察心肌细胞的比例作为凋亡指数，即心肌细胞凋亡指数(%)=(凋亡心肌细胞系数/正常心肌细胞系数)×100%。每组计数25个阳性视野(每组5张切片，各取5个阳性视野)，取平均值。

1.2.6 HE染色观察心肌细胞：将剩余梗死心肌组织置于40 g/L中性甲醛液中固定，经石蜡包埋后，取心脏冠状面最大横径处切片，连续切片3张(厚4 μm)，用于HE染色，以观察组织的大致形态、心肌细胞走向及心肌纤维化程度、细胞形态学及炎性细胞浸润情况。

1.2.7 Western blot测定Bcl-2和Bax表达：提取总蛋白质并进行定量。制胶，制备蛋白质样品并加样，免疫印迹显色，烤干保存硝酸纤维素滤膜或摄影，图像分析仪测定条带的吸光度值，并作定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 实验动物的一般情况

大鼠在造模的过程中有一定的死亡，存活率为87.5%，主要死因为麻醉过量、大出血、恶性心律失常。

2.2 血流动力学结果

与假手术组比较，MI大鼠 LVSP、dP/dTmax及dP/dTmin均显著降低，LVEDP显著升高。与MI组比较，3个药物干预组LVSP、dP/dTmax及 dP/dTmin均显著提高，LVEDP显著降低；上述指标的改善以 MI+T+R组更明显(表1)。

2.3 各组大鼠心肌缺血重量及梗死重量的变化

心肌梗死后，大鼠缺血心肌重量(AAR)、梗死心肌重量(AN)以及AAR/LV均显著增加(与假手术组组比：P<0.01)。药物干预后，AAR、AN、AAR/LV和AN/AAR均显著降低(与MI组比：P<0.05)。此外，与MI+R组和MI+T组相比，MI+T+R组AAR、AN、AAR/LV和AN/AAR改善更显著(P<0.05)(表2)。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡指数

与假手术组相比，MI大鼠的心肌凋亡细胞数显著增多(P<0.01)，且阳性细胞呈灶性分布，尤其以MI组最多。当给予不同药物干预后，与MI组相比，凋亡细胞数显著减少(P<0.05)，以MI+R+T组减少最为明显(图1，表3)。

2.5 HE染色检测心肌纤维化

假手术组大鼠心肌细胞形态正常，肌纤维排列致密、整齐，间质成纤维细胞数量、形态正常(图2A)。MI组大鼠心肌纤维排列疏松，间质成纤维细胞显著增生，胶原纤维增生、变粗，并且将心肌细胞分割呈网筛状，可见少量炎性细胞浸润(图2B)。与MI组相比， MI+T组大鼠心肌纤维化程度显著减轻，心肌细胞排列较为规整(图2C)。与MI组相比，MI+R组大鼠心肌胶原成分显明减少，排列较为规则(图2D)。与MI组相比，MI+T+R组大鼠心肌胶原成分减少，但与假手术组大鼠相比仍存在纤维化改变(图2E)。

表1 各组血流动力学参数Table 1 Hemodynamic parameters of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group(1 mmHg=0.133 kPa).

表2 各组大鼠心肌缺血重量和梗死重量比较Table 2 Myocardial ischemia weight and infarction weight of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

A.sham; B.MI; C.MI+T; D.MI+R; E.MI+R+T图1 各组大鼠心肌细胞的TUNEL染色Fig 1 TUNEL stains in all groups (×400)

A.Sham; B.MI; C.MI+T; D.MI+R; E.MI+R+T图2 各组大鼠治疗后的心肌细胞HE染色Fig 2 HE stains after treatment in all groups (×400)

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡指数Table 3 Apoptosis index of all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

2.6 Western blot检测Bcl-2和Bax表达

正常大鼠心肌中Bcl-2和Bax低表达或不表达。MI能显著增加Bcl-2和Bax蛋白表达(P<0.01)，以Bax蛋白表达增加为主，且MI组表达增加最明显。给予大鼠药物干预后，与MI组相比，Bcl-2与Bax表达均相应降低(P<0.01)，以Bax减少为主。MI+R+T组与MI+R组和MI+T组相比，Bcl-2与Bax表达明显下降(P<0.01)(图3)。

3 讨论

冠状动脉栓塞后的急性期，局部心肌出现微梗死灶，心肌细胞出现坏死和凋亡，凋亡相关基因Bcl-2/Bax表达也相应增加，心功能呈进行性下降[3]。

1.sham; 2.MI; 3.MI+T; 4.MI+R; 5.MI+R+T图3 各组大鼠心肌中的Bcl-2和Bax表达Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax in all groups

表4 各组大鼠心肌中的Bcl-2和Bax表达Table 4 Expression of Bcl-2 and Bax in all groups

*P<0.01 compared with sham group；#P<0.01 compared with MI+R group or MI+T group.

本研究结果显示，光镜下，心肌梗死大鼠心肌梗死灶周围区域可见凋亡细胞。给予药物治疗后，心肌梗死面积显著缩小，凋亡细胞也明显减少。血流动力学方面，药物治疗后，大鼠反应心脏收缩功能和左室收缩速率的指标有所提高，而反应心脏舒张功能的指标有所下降，说明药物治疗可以减轻心脏的僵硬度。

目前，心肌梗死的发病机制尚未完全阐明，通常认为与氧自由基增加﹑钙超载﹑中性粒细胞浸润、微血管损伤、细胞凋亡以及能量代谢障碍等有关[4]。离体和在体实验表明，细胞凋亡是心肌梗死发病机制的一个重要环节。细胞凋亡的发生是由基因控制的，Bcl-2 家族[5]在细胞凋亡中起重要作用，其成员构成一个复杂的网络，调节细胞凋亡。Bcl-2在各种正常细胞发育过程中存在表达，而成熟和凋亡的细胞中不表达或低表达。Bax基因可能通过与Bcl-2基因本身或Bcl-2基因产物相互作用而发挥功能[5]。本研究发现，正常大鼠心肌中Bcl-2和Bax低表达或不表达，而心肌梗死大鼠Bcl-2和Bax蛋白表达明显增强，以Bax蛋白表达增加为主。Bcl-2蛋白上调，从而其抑制心肌细胞凋亡的能力增加。给予药物干预后，Bcl-2与Bax表达均相应降低，以Bax减少为主，说明干预细胞凋亡主要以抑制Bax表达为主。

他汀类药物又称 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A(HMG-COA)还原酶抑制剂。HMG-COA 还原酶是胆固醇合成代谢中的关键限速酶，瑞舒伐他汀可竞争性抑制该酶的作用，使胆固醇合成减少，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)清除增加，并有降三酰甘油作用[1]。研究发现，短期应用瑞舒伐他汀对大鼠缺血心肌有保护作用，主要是通过激活磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)信号通路，提高内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的活性，增加 NO来实现的[4]。

曲美他嗪[2,6]是第一个临床用于治疗冠心病的代谢药物，具有抗缺血和抗心绞痛作用。曲美他嗪能抑制β-脂肪酸氧化，抑制心肌对脂肪酸的摄取，并增加葡萄糖的氧化，导致游离脂肪酸向葡萄糖氧化的心脏代谢转换，从而改善心肌能量利用，增加线粒体氧化代谢，减轻细胞内酸中毒及钠、钙堆积，预防氧自由基引起的心肌细胞损伤。

本实验显示，给予瑞舒伐他汀和曲美他嗪干预后，心肌细胞AI、心肌血流动力学参数以及心肌纤维化程度均有一定的改善。同时，Bcl-2和Bax蛋白表达减少，而以Bax表达减少为主。需指出的是，瑞舒伐他汀与曲美他嗪联合用药组效果最好。说明瑞舒伐他汀与曲美他嗪干预在抑制心肌细胞凋亡、抑制心肌纤维化、改善血流动力学参数等方面有协同作用。

综上所述，心肌细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和Bax的表达介导了心肌缺血再灌注损伤，瑞舒伐他汀和曲美他嗪治疗减少了心肌细胞的凋亡，而曲美他嗪与瑞舒伐他汀的联合应用可显著抑制Bax的表达，从而抑制心肌纤维化、心肌细胞凋亡和改善血流动力学。本研究的结果将为临床防治心肌缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点。

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The effect of trimetazidine and/or rosuvastatin on improving the cardiac function damage of rats with myocardial infarction

TAN Li-li1,LIU Li-min2*,LI Lu1,ZHAO Hong-li1

(1.Dept.of Cardiology,the Shenzhou Hospital Affilicated to Shenyang Medical College,Shenyang 110035;2.Cadres Clinics,Shenyang Medical College,Shenyang 110000,China)

Objective To investigate the cardioprotection of trimetazidine and/or rosuvastatin in rats with myocardial infarction (MI).Methods MI was introduced to SD rats by ligating the left anterior descending coronary.Rats were randomly assigned into following groups:sham group,Mi group,trimetazidine (T)+ MI group,rosuvastatin (R)+ MI group and T+ R+ MI group.After treatment for 14 days,all groups’ hemodynamic parameters were measured.Apoptosis index (AI) was detected by TUNEL staining.The myocardial infarction area was measured by Evans/TTC staining.The expression of Bcl-2 and bax was determined by Western blot assay.Results When compared with sham group,the LVSP,dP/dTmax and dP/dTmin of MI rats significantly reduced (P<0.01),but LVEDP markedly increased (P<0.01).When compared with the MI group,the LVSP,dP/dTmax and dP/dTmin in the T+MI group,R+MI group and T+R+MI group significantly increased,and the LVEDP dramatically reduced (P<0.05).The apoptosis index in the MI group significantly increased accompanied by marked increase in the expression of Bcl-2 and Bax,especially the Bax when compared with sham group.After treatment with T and R,the apoptosis index reduced and the expression of Bcl-2 and Bax decreased significantly,mainly the Bax.The above changes were the most evident in the T+R+MI group.Conclusions Treatment with T and/or R can improve the heart function of MI rats,which may be attributed to the reduction in the apoptosis index and decrease in the expression of Bax and Bcl-2 in the myocardium.The cardioprotection is the most obvious after treatment with T and R suggesting the synergistic effect.

myocardial infarction; apoptosis; trimetazidine; rosuvastatin

2014-04-28

2014-12-03

沈阳市科技局科技支撑项目(2011F11-264-1-48)

*通信作者(corresponding author)：lmliu@126.com

1001-6325(2015)03-0355-05

R542.2

A