青藤碱降低兔膝骨关节炎模型脂联素含量及其受体表达

郑 洁，罗 浩，王瑞辉，寇久社

(陕西中医学院1.针灸推拿系;2.医学技术系;3.第二附属医院 康复针灸科，陕西 咸阳712046)

近年发现，脂联素(aAdiponectin)在炎性反应、软骨退变以及软骨下骨重塑等多个骨关节炎(osteoarthritis，OA)病理过程中发挥了重要作用。青藤碱是从传统治疗风湿性疾病中药清风藤中提取的一种生物碱，具有镇痛、抗感染、调节免疫、降血压、抗心律失常等药理作用。我们前期实验研究发现，青藤碱关节腔注射可缓解兔膝骨关节炎(KOA)滑膜炎性反应、降低关节液内脂素和抵抗素水平，对软骨具有保护作用。本实验通过观察盐酸青藤碱关节腔注射对木瓜蛋白酶诱导的兔KOA 模型血清及关节液中脂联素水平以及软骨中脂联素受体-1(Adipo-R1)和脂联素受体-2 (Adipo-R1)的mRNA 和蛋白表达的影响，探讨青藤碱治疗KOA的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂:新西兰大白兔35 只(1.8～2.2 kg)，雌雄各半[西安交大医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(陕)2008-008]。脂联素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(北京诺博莱科技有限公司)，Adipo-R1 和Adipo-R2 多克隆抗体(Abcam 公司)，RNA 提取和qPCR 反应试剂盒(北京全式金公司)，正清风痛宁注射液(湖南正清制药集团股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组:实验分为对照组(control)、模型组(model)、透明质酸钠组(HA)和青藤碱组(SIN)，除空白组所有兔均采用木瓜蛋白酶注射法复制KOA 模型。根据成人用药剂量按Meeh-Rubner 公式计算人兔等效剂量。除对照组外，对各组动物造模侧膝关节行关节腔注射，SIN 组膝关节腔注射盐酸青藤碱注射液0.2 mL(5 mg)，每3 天1次，10次1疗程，共给药10次;HA组膝关节腔注射透明质酸钠注射液0.2 mL，每6 天1次，5次1 疗程，共5次;模型组膝关节腔注射0.9%氯化钠溶液0.2 mL，注射次数同HA组。干预时间共计30 d。

1.2.2 ELISA法检测兔血清及关节液脂联素含量:操作方法严格按着试剂盒说明进行。

1.2.3 qPCR 法检测膝关节软骨Adipo-R1 和Adipo-R2的mRNA表达:按试剂盒说明提取总RNA，反转录和扩增。结果以2－ΔΔCT表示。

1.2.4 Western blot 法检测膝关节软骨Adipo-R1 和Adipo-R2的蛋白表达:用RIPA 裂解液提取总蛋白，BCA法测定其浓度和纯度，取适量样品进行SDA-PAGE。Image J 软件进行灰度扫描。

2 结果

2.1 血清及关节冲洗液中脂联素水平:模型组和HA组显著高于空白组(P＜0.01);SIN 组明显低于模型组(P＜0.01，P＜0.05)(表1)。

表1 血清及关节液脂联素浓度Table1 Concentration of adiponectin in serum and synovium(μg/L)(±s)

表1 血清及关节液脂联素浓度Table1 Concentration of adiponectin in serum and synovium(μg/L)(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model;ΔP＜0.05 compared with HA.

group n serum synovium fluid control 8 7.333±0.492 7.333±0.492 model 9 10.249±1.373＊＊ 10.249±1.373＊＊HA 9 9.889±0.673＊＊ 9.889±0.673＊＊SIN 9 8.593±0.793* ##Δ 8.593±0.793* #Δ

2.2 软骨Adipo-R1 和Adipo-R2的mRNA 及蛋白表达情况:model 组Adipo-R1 显著高于对照组(P＜0.05)，SIN 组和HA组明显低于模型组(P＜0.05);模型组、HA组和SIN 组Adipo-R2 均显著高于对照组(P＜0.01)(表2，图1)。

表2 软骨Adipo-R1、Adipo-R2 mRNA 及蛋白表达水平Table2 Expression of Adipo-R1 and Adipo-R2 in cartilage (±s，n=3)

表2 软骨Adipo-R1、Adipo-R2 mRNA 及蛋白表达水平Table2 Expression of Adipo-R1 and Adipo-R2 in cartilage (±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group Adipo-R1 Adipo-R2 mRNA protein mRNA protein control 1.000±0.000 0.103±0.006 1.000±0.0000.293±0.007 model 2.709±0.883* 0.744±0.036* 5.795±0.225＊＊ 0.463±0.030＊＊HA 1.663±0.100# 0.397±0.005* ## 5.014±0.885＊＊ 0.431±0.010＊＊SIN 1.427±0.024# 0.350±0.006* ## 4.952±0.820＊＊ 0.458±0.009＊＊

图1 软骨Adipo-R1 和Adipo-R2的蛋白表达Fig1 Expression of Adipo-R1 and Adipo-R2 protein in cartilage

3 讨论

脂联素在OA 发病过程中不仅扮演了促炎因子的角色，还在后期软骨基质的降解中发挥了重要作用。OA 患者关节液脂联素含量显著升高，与白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平呈正相关[1]。脂联素主要是通过其受体Adipo-R1 和Adipo-R2 发挥作用，OA 患者软骨损伤区Adipo-R1 和Adipo-R2表达显著高于非损伤区[2]。青藤碱膝关节腔注射可降低KOA 兔关节液IL-1β 及PGE2 含量，对OA 软骨具有保护作用[3]。

本实验ELISA 结果表明，青藤碱关节腔注射可显著降低KOA 兔血清及关节液中升高的脂联素水平。软骨Adipo-R1和Adipo-R2 基因和蛋白表达检测结果显示，KOA 兔软骨Adipo-R1 和Adipo-R2 均呈高表达，与文献报道一致，青藤碱关节腔注射可明显下调Adipo-R1 在软骨的表达，但对Adipo-R2的高表达无抑制作用。提示降低血清及关节液脂联素含量以及下调Adipo-R1 在软骨的表达可能是青藤碱关节腔注射治疗OA的机制之一。

[1]Gross JB，Guillaume C，Gégout-Pottie P，et al.Synovial fluid levels of adipokines in osteoarthritis:Association with local factors of inflammation and cartilage maintenance[J].Biomed Mater Eng，2014，24:17-25.

[2]Kang EH，Lee YJ，Kim TK.et al.Adiponectin is a potential catabolic mediator in osteoarthritis cartilage[J].Arthritis Res Ther，2010，12:R231.

[3]吴红娟，孙必强，朱传湘，等.盐酸青藤碱对家兔骨关节炎关节液IL-1β、PGE2 生成与关节组织结构的影响[J].湖南中医药大学学报，2010，30:84-86.