羊水细胞原代培养和传代培养方法比较

肖 婕，张万兴，王 欢，余艳婷，袁金兰

（吉安市妇幼保健院遗传室，江西吉安343000）

羊水细胞原代培养和传代培养方法比较

肖 婕，张万兴，王 欢，余艳婷，袁金兰

（吉安市妇幼保健院遗传室，江西吉安343000）

羊水细胞培养及染色体核型分析是产前确诊染色体疾病诊断的金标准，为妊娠中晚期胎儿临床诊断提供可靠的科学依据。羊膜腔穿刺是损伤性的取样技术，对孕妇和胎儿有造成损伤、感染、流产的潜在危险，流产发生率约0.5%［1］。羊水细胞培养因技术要求高、难度大、周期长、易污染、分裂相少，一旦培养失败，孕妇难接受第二次穿刺取样。因此，提高羊水细胞培养成功率是关键。本研究就羊水细胞的原代培养和传代培养两种方法比较。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2013年7月－2014年7月我院产前诊断中心对因各种产前诊断指征就诊的169名孕妇，孕周16－26不等，行羊膜腔穿刺术取羊水做染色体检查。

1.2 培养试剂和器材 CO2培养箱，T型培养瓶（CORNING，型号430639），离心机，倒置显微镜，购自BioAMF羊水培养基，广州达晖公司提供40μg／ml的秋水仙碱。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 在B超引导下，经腹穿刺抽取羊水30ml左右，分装入2支一次性无菌离心管中，尽快送达实验室接种。

1.3.2 接种 羊水以1 700r／min离心10分钟。在超净工作台内，弃去上清液，保留0.5ml沉淀，加入5ml羊水培养基吹打混匀。将混匀的两份羊水细胞分别移入两个T型培养瓶中，静置于CO2培养箱中，温度37℃，CO2浓度5%。

1.3.3 细胞原代和传代培养 细胞培养6－7天后观察细胞贴壁及生长情况，此时可见瓶底贴壁细胞已形成克隆。取一瓶做原代培养，直接更换新鲜培养液继续培养，注意观察细胞生长情况，适时收获。另一瓶行传代培养，弃去原培养液加入新鲜培养液后，用刮刀使瓶壁细胞脱离瓶壁，经吹打混匀后，再次置于培养箱中继续培养，36小时后观察羊水细胞克隆大小，适时收获。

1.3.4 细胞收获 在倒置显微镜下观察羊水克隆大小及数目，适时加入秋水仙碱处理4－5小时后收获细胞，用柠檬酸钠与氯化钾1∶1，低渗12分钟加入固定液，预固定8分钟，离心后去上清液，固定30分钟后离心。重复做二次固定后，原代与传代培养每份标本分别滴片四张。

1.3.5 烤片和显带 置75－80℃烤箱中烤3小时，用胰酶消化4－5分钟，行Giemsa染色20分钟。

1.3.6 观察和计数 每例标本实验组与对照组均取第2号玻片，由一人阅片一人核对，分别计数核型出现数、可计数数、可分析数。

1.3.7 统计学分析 应用SPSS13.0软件行t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 羊水细胞生长收获情况 169例羊水中，原代培养成功162例，成功率95.86%，羊水平均收获时间为7－8天，同一批羊水常常需要分2—3批次收获；传代培养成功率为100%，其中＞20＋6孕周孕妇羊水32例均培养成功。培养时间为8天，收获时间基本一致，一次即可收获完成。羊水染色体不同孕周培养成功率见表1。

表1 羊水染色体不同孕周培养成功率

2.2 染色体核型分析情况 两种方法染色体核型都比较好。原代培养法获得至少20个可计数型的标本为150例，占已收获标本总量的92.59%；传代培养法获得至少30个可计数核型的标本为152例，另获得至少20个可计数核型标本为17例，完全可符合WS322.2－2010中华人民共和国卫生行业标准规定观察报告标准数量。具体羊水染色体分裂相出现情况见表2。

表2 羊水染色体分裂相出现结果

3 讨论

羊水细胞主要来源于胎儿的皮肤、消化道、呼吸道等处，大部分是衰老和固缩的脱落细胞，这使羊水细胞培养较其他组织如外周血细胞、皮肤细胞的培养更为困难［2］。尤其是孕中晚期随着孕周的增加羊水细胞虽有增长，但细胞活性低影响培养成功率。通过对比实验对比，我们发现：（1）用原代培养较羊水传代培养步骤更简单，无需进行传代，减轻培养期间工作量；不传代避免因操作造成培养污染；不传代还避免羊水细胞再贴壁的时间从而缩短羊水报告时间。在羊水克隆较多的情况下，培养成功率很高，便于核型分析。但由于同批羊水，生长情况不同，常常要分2－3批收获。（2）实验显示羊水传代培养成功率为100%，有足够的染色体核型便于分析工作。当羊水细胞克隆较少时，进行传代培养明显提高了培养成功率。对于大孕周胎儿染色体核型分析，此方法有优势明显。培养6－7天时，我们可以在倒置显微镜下发现贴壁细胞相互堆集在一起，互相影响不利于生长。我们通过换液后让羊水细胞脱离瓶壁，重新贴壁更利于生长从而获得更多更好的分裂相。而且由于细胞再次贴壁时间相同，使得细胞成熟时间基本一致，大大减小了收获的工作量。（3）在传代培养中存在部分异常染色体嵌合情况，同一份标本原代培养片中没有发现异常。据吴坚柱的文章报道羊水的嵌合体发生机制中，染色体制片过程中外力作用使染色体发生断裂重接、丢失或增加［3］。传代培养是否增加了假嵌合的风险有待近一步研究。

染色体分析水平的正确性和准确性与否，取决于染色体标本的分裂相数，显带的带纹清晰、丰富、分散效果等问题。制备较高质量的染色体标本防污染是培养的关键。技术操作中手法的轻巧是防止丢失的一环。选择合适的低渗液、固定液及时间是染色体分散显带较丰富的重点。

［1］边旭明，邬玲仟，姜玉新.实用产前诊断学［M］.北京：人民军医出版社，2008：187－188.

［2］Turhan NO，Eren U，Seckin NC.Second－trimester genetic amnio－centesis：5－year experience［J］.Arch Gynecol Obstet，2005，271（1）：19.

［3］吴坚柱，林少宾，张志强，等.63例羊水嵌合体的临床分析［J］.中华医学遗传学杂志，2014，31（4）：523.

2014－08－20）

1007－4287（2015）10－1795－02