肾移植受者血清抗体IgG1及IgG3亚型介导对凋亡细胞的反应性并激活补体途径

徐志强，荣春书，高宝山

（1.通辽市医院泌尿外科，内蒙古通辽028000；2.长春市中医药大学附属医院；3.吉林大学第一医院泌尿系统疾病诊治中心）

肾移植受者血清抗体IgG1及IgG3亚型介导对凋亡细胞的反应性并激活补体途径

徐志强1，荣春书2，高宝山3＊

（1.通辽市医院泌尿外科，内蒙古通辽028000；2.长春市中医药大学附属医院；3.吉林大学第一医院泌尿系统疾病诊治中心）

目的检测肾移植受者术前血清内多反应性IgG抗体亚型与凋亡细胞的反应性及与补体激活途径的关系，初步探讨此类抗体导致移植肾排异反应及影响移植肾存活的机制。方法 选取50例肾移植患者术前血清学标本，应用流式细胞技术检测血清内IgG抗体亚型（IgG1－IgG4）对凋亡细胞的反应性，并检测此类抗体与凋亡细胞反应后，能否激活补体途径，导致C4d沉积于靶细胞表面，并分析IgG亚型对凋亡细胞反应强度与C4d在靶细胞表面沉积强度的相关性。结果 肾移植患者血清内IgG抗体对凋亡细胞的反应性主要由IgG1及IgG3亚型介导，而极少患者的血清由IgG2或IgG4介导对凋亡细胞的反应，IgG1及IgG3亚型对凋亡细胞的反应性与C4d在靶细胞表面沉积强度呈显著相关性（P＜0.001，P＝0.005）。结论 本研究初步揭示肾移植患者血清内多反应性IgG抗体通过IgG1及IgG3亚型介导对凋亡细胞的反应性，并可能通过激活补体途径造成移植肾损伤。

肾脏移植；多反应性抗体；凋亡细胞；补体

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1683）

抗体介导的移植肾排异反应是导致移植肾失去功能的主要原因，也是影响移植肾长期存活的关键性因素。目前广泛认为，器官移植后移植物发生抗体介导排异反应及移植物失功主要与受者供体特异性抗体（Donor specific antibodies，DSA）的产生密切相关，而非供体特异性抗体（Non－donor specific antibodies，NDSA）对移植物存活的影响尚未得到足够重视。然而有文献报道，器官移植受者血清中未产生DSA的情况下，仍然存在针对移植物的抗体介导的排异反应［1，2］。另有研究报道，器官移植患者体内诸如血管紧张素受体、抗波形蛋白抗体、抗过氧化脂类抗体等诸多自身抗体与移植物的排异反应密切相关并影响移植物长期存活［3－6］。除了DSA之外，NDSA也是影响移植物存活的重要因素。

我们在前期研究中发现［7］，肾移植受者血清内对凋亡细胞具有反应性的IgG抗体与移植肾排异反应显著相关，并能够影响移植肾长期存活，但其中机制尚不明确。本研究拟通过揭示肾移植受者血清内IgG亚型对凋亡细胞的反应性及是否能够激活补体途径来初步探讨此类抗体导致移植肾排异反应及影响移植肾存活的机制。

1 材料与方法

1.1 患者一般资料

本研究所用血清标本来源于2013年7月至2014年2月期间于吉林大学第一医院首次行同种异体肾移植手术的患者。50例患者的基本资料如表1所示。

表1 患者一般资料

1.2 方法

1.2.1 凋亡细胞制备 Jurkat细胞株0.5×106／ml与200ng／ml抗FAS抗体于37℃孵育箱内15小时。Annexin－V及7－AAD（BD公司）染色以确认细胞凋亡。

1.2.2 血清IgG纯化 将患者与纯化缓冲液以1∶10混匀后加入预装有吸附胶体及滤膜的纯化容器，6 000rpm离心2min，通过滤膜落入Eppendorf试管中的稀释血清即纯化后的IgG抗体，收集待用。

1.2.3 IgG亚型（IgG1－IgG4）对凋亡细胞的反应性将分别从50例患者血清中纯化的IgG抗体与1 ×106诱导凋亡后的Jurkat细胞株混匀，37℃孵育30min，低温洗涤二次后，分别向标本中加入PE耦联的抗IgG1、抗IgG2、抗IgG3及抗IgG4的二抗，4℃避光孵育30min。低温洗涤二次后，应用流式细胞仪检测IgG亚型（IgG1－IgG4）对凋亡细胞的反应性。反应强度用平均荧光强度（MFI）表示。

1.2.4 C4d沉积实验 0.5×106Jurkat凋亡细胞分别与60μl稀释成1∶2的纯化后血清IgG在FACS试管中混匀，37℃孵育30min。健康自愿者血清用Hank’s平衡盐缓冲液稀释成1∶100做为补体来源加入样本，37℃孵育15min。低温洗涤二次，于反应体系中加入抗C4d二抗，4℃避光孵育30 min。低温洗涤二次，加入FITC耦联的鼠抗人IgG二抗，4℃避光孵育30min。低温洗涤二次后，应用流式细胞仪检测凋亡细胞表面C4d沉积情况。C4d沉积强度用MFI表示。

1.3 统计学处理

Mann－Whitney检验用于比较IgG亚型（IgG1－IgG4）之间对凋亡细胞的反应性。Spearman相关性检验用于统计IgG1、IgG3对凋亡细胞的反应性与凋亡细胞表面C4d沉积强度之间的相关性。所有检验均为双向检验，P值＜0.05具有统计学意义，数据分析应用Graph Pad Prism 5.0统计软件完成。

2 结果

肾移植患者血清IgG亚型对凋亡细胞的反应性。通过对50例患者血清学检测发现，IgG1或IgG3或此两种亚型共同介导对凋亡细胞的反应性，而极少患者的血清由IgG2或IgG4介导对凋亡细胞的反应（图1）。

血清IgG1及IgG3亚型与凋亡细胞反应后激活补体途径。在移植肾功能异常的病例中，可通过检测移植物组织中C4d的沉积来揭示是否有补体途径的参与［8，9］。本研究中，我们利用体外实验检测肾移植患者血清IgG与凋亡细胞反应后能否激活补体途径（图2）。结果显示，IgG1或IgG3亚型可与凋亡细胞发生反应并激活补体途径，从而介导C4d沉积于靶细胞表面。进一步分析显示，IgG1及IgG3亚型对凋亡细胞的反应性与C4d在靶细胞表面沉积强度呈显著相关性（P＜0.001，P＝0.005，图3）。

图1 血清IgG亚型（IgG1－IgG4）对凋亡细胞的反应性。（A）通过流式细胞仪检测的4例具代表性肾移植患者血清IgG亚型对凋亡细胞的反应性。灰色区域代表仅应用IgG亚型二抗所获得的背景，实线代表各IgG亚型的反应性。（B）分别检测50例患者血清IgG亚型（IgG1－IgG4）对凋亡细胞的反应性，灰色色阶代表反应强度MFI，颜色越深表示反应性越强

图2 患者血清IgG与凋亡细胞反应后导致C4d沉积于凋亡细胞表面

图3 IgG亚型对凋亡细胞反应性与C4d沉积于靶细胞表面的相关性

3 讨论

同种异体肾移植术是治疗终末期肾衰竭的有效方法。抗体的存在是导致移植肾排异反应的主要原因，也是导致移植肾失功的关键因素。长久以来，针对器官移植领域抗体的研究绝大多数集中于DSA，而NDSA及其他抗体在器官移植领域中的作用尚未得到足够重视。我们在前期研究中发现［7］，肾移植受者血清内多反应性抗体能够与凋亡细胞反应，且此类抗体的活性与移植肾排异反应显著相关，并能够影响移植肾长期存活，但其中机制尚不明确。晚期的移植肾失功经常伴有补体途径的参与，表现为C4d沉积于靶器官的表面，在此过程中，IgG1和IgG3亚型发挥了重要的作用。在此线索的指引下，结合本研究结果，我们认为，能够与凋亡细胞反应的IgG1和IgG3亚型很可能参与受者总体的免疫反应并通过激活补体途径造成移植物的损伤及失功。肾移植患者血清IgG与凋亡细胞的反应性主要由抗体亚型IgG1及IgG3介导，这种现象的原因尚不明确，可能是能与凋亡细胞反应的B淋巴细胞接受抗原刺激的类型不同从而驱动优先向IgG1和IgG3亚型转换。其可能的机制是凋亡细胞通过B细胞受体（B cell receptor，BCR）、共刺激分子以及Toll样受体（Toll－like receptor，TLR）传递伴随信号，从而引导CRS向IgG1和IgG3亚型转换。值得关注的是，IgG1和IgG3亚型均具有很强的补体激活特性。

本文通过研究肾移植受者血清内IgG亚型对凋亡细胞的反应性及是否能够激活补体途径，初步揭示肾移植患者血清内多反应性抗体导致移植肾损伤的可能机制。

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Serum IgG1 and IgG3 subclass antibodies in kidney transplant recipients dominate the reactivity to apoptotic cells and acti－vate complement pathway

XU Zhi－qiang，RONG Chun－shu，GAO Bao－shan.
（Department of Urology，Inner Mongolia Tongliao Hospital，Tongliao 028000，China）

ObjectiveTo investigate the association between reactivity of IgG subclass in kidney transplant recipients to apoptotic cells and complement activation and explore the mechanism of effect of polyreactiveIgG on kidney allograft rejection and graft loss.Methods Pre－transplant serum samples were selected form 50kidney transplant recipients.Reactivity of IgG subclass to apoptotic cells was detected using flow cytometry.We also observed whether polyreactive IgG could activate complement pathway，leading C4ddeposition on target cells after binding to apoptotic cells.The association between reactivity of IgG subclass to apoptotic cells and C4ddeposition on target cells was analyzed.Results Our studies showed that IgG reactivity to apoptotic cells was almost exclusively mediated by IgG1and IgG3 subclasses.Few samples showed IgG2or IgG4reactivity to apoptotic cells.Moreover，we observed a strong association between IgG1and IgG3reactivity to apoptotic cells and C4ddeposition on target cells（P＜0.001，P＝0.005）.Conclusion Our studies preliminarily revealed that reactivity of polyreactive IgG in kidney transplant recipients to apoptotic cells was mediated by IgG1and IgG3subclasses，they lead to kidney allograft injury probably through activation of complement pathway.

Kidney transplantation；Polyreactive antibodies；Apoptotic cells；Complement

R392.4

A

2014－10－09）

1007－4287（2015）10－1683－04

＊通讯作者

文章编号：1007－4287（2015）10－1686－03