联合自噬抑制剂增加PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235诱导的结肠癌细胞凋亡

斯庆图娜拉

（鄂尔多斯市中心医院，内蒙古鄂尔多斯017000）

联合自噬抑制剂增加PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235诱导的结肠癌细胞凋亡

斯庆图娜拉

（鄂尔多斯市中心医院，内蒙古鄂尔多斯017000）

目的探讨自噬对I3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的影响。方法PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235和（或）自噬抑制剂3－MA处理人结肠腺癌DLD1细胞，MTT法检测细胞生存率，流式细胞术检测细胞凋亡率的变化，Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果 不同浓度的NVP－BEZ235作用于人结肠腺癌DLD1细胞24h后，MTT及流式细胞术结果显示，明显地抑制了细胞增殖，并增加了细胞凋亡率，同时观测到凋亡相关蛋白Caspase－3表达升高；采用3－MA特异性抑制自噬活性后，明显地增加了NVP－BEZ235诱导的细胞凋亡率；同时，检测到凋亡相关蛋白Caspase－3的表达上调。结论 自噬在NVP－BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的过程中起保护作用，3－MA抑制自噬后，促进了NVP－BEZ235诱导人结肠腺癌DLD1细胞凋亡，联合应用PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235和自噬抑制剂3－MA有望成为人结肠癌的新治疗策略。

自噬；PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235；3－MA；凋亡；人结肠癌

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1632）

随着癌症的发病率逐年增加，目前结直肠癌也已逐渐成为了常见的癌症之一［1］。早期的结直肠癌患者能够通过手术进行治疗；而大部分结直肠癌被诊断时已处于晚期阶段，因而化疗成为辅助外科手术治疗晚期结直肠癌患者的主要手段［2］。然而，化疗对于晚期阶段的结直肠癌治疗的效果并不理想，并且逐渐出现化疗药物耐受现象。因此，研究出有效治疗结直肠癌患者的新药物成为主要的问题。

NVP－BEZ235，是一种新型的PI3K和mTOR的双重抑制剂，能够特异性的抑制PI3K和mTOR的活性［3］。最近几年，在癌症的研究中，PI3K／AKT／mTOR信号通路已经成为的研究的热点［4］。PI3K／AKT／mTOR信号通路作为许多信号的上游因子，能刺激大量的下游效应器活化，因此能够介导细胞存活和生长［4］。因此，这个信号的异常的活化在恶性肿瘤中也是常见［5］。PI3K和mTOR除了参与细胞增殖外，还可以抑制细胞自体吞噬（autophagy）的发生［6］；自噬是细胞的溶酶体降解的通路，它能够维护细胞的内稳态，对于细胞存活的调控是必要的［7］。自噬的一个关键的调控因子是mTOR，在生成因子和营养丰富的条件下，mTOR的抑制能够诱导自噬的发生［8］。自噬发挥促存活或者促死亡的作用依赖于环境条件，因此在癌症的治疗上发挥了双刃剑的作用。自噬吞噬的发生往往对于化疗药物引起的凋亡表现出一定的保护作用，因此，联合应用NVP－BEZ235和自噬抑制剂可能可以明显的提高NVP－BEZ235引起的结肠腺癌细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 自噬抑制剂3－MA和噻唑蓝MTT购自美国Sigma公司，PI3K／mTOR抑制剂NVPBEZ235购自LC Laboratories公司，AnnexinV／PI双染的凋亡试剂盒购于Invitrogen公司，鼠抗人βactin单抗、兔抗人Caspase－3多抗购于Santa Crus公司，ECL显色液购自Thermo Scientific公司。

1.1.2 细胞株 人结肠腺癌DLD1细胞株购于美国ATCC细胞库，细胞培养于含有100U／ml青霉素和链霉素的RPMI－1640＋10%FBS的培养液中，于37℃、5%CO2的细胞培养箱培养。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT法检测细胞的增殖率 选取生长状态良好的对数期人结肠腺癌DLD1细胞，以每孔含有8000个细胞的浓度接种于96孔板，待24h后细胞完全贴壁，换成含有不同药物浓度的培养液，每孔200μl，待药物处理24后，每孔中加入20μl的MTT（5mg／ml），于孵箱中孵育4－6h，选择酶标仪上490nm波长测定各孔的吸光值，计算出细胞生存率。

1.2.2 流式细胞仪技术检测细胞的凋亡率 选取生长状态良好的对数期人结肠腺癌DLD1细胞，以5×105个细胞／孔接种于6孔板中，培养24h后待细胞贴壁后换含有不同药物浓度的培养液处理24 h，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞，加入适量的AnnexinV／PI溶液，置于室温，避光孵育15min；使用流式细胞仪检测细胞的凋亡率，每组实验重复进行3次。

1.2.3 Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达选取生长状态良好的对数期人结肠腺癌DLD1细胞，按2×105／孔细胞接种于75ml细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后换成含有不用药物浓度的培养液作用24h后，收获贴壁细胞和悬浮细胞，离心并用PBS洗涤细胞2次，加入RAPI裂解液，提取细胞中的蛋白，SDS－PAGE胶电泳后，用100V，120min将蛋白电转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶的PBST室温封闭2h，再加入合适浓度的相应一抗，于4℃孵育过夜后，用PBST洗涤3次，15min，5min，5min后，加入相应的辣根过氧化酶标记的二抗室温2h，再用PBST洗涤3次，15min，5min，5min后，使用ECL进行显色。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件对实验数据进行方差分析，结果以x—±s表示，两组数据间的比较采用t检验进行分析。与对照组相比，实验组的数据以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞生存率的影响

0nM、50nM、100nM、200nM的NVPBEZ235干预DLD1细胞24h后，MTT结果显示，NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞呈明显的浓度依赖关系，对细胞增殖的抑制作用随着NVPBEZ235浓度的增加而增强，呈现明显的剂量依赖的现象（图1）。

图1 PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞生存率的影响

2.2 PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞凋亡率的影响

AnnexinV／PI染色后流式细胞术结果显示，0 nM、50nM、100nM、200nM的NVP－BEZ235作用于人结肠腺癌DLD1细胞24h后，与对照组相比，细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高，并呈现明显的浓度依赖性（图2）。

图2 NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的影响

2.3 PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞中凋亡相关蛋白的表达的影响

0nM、50nM、100nM、200nM的NVPBEZ235处理人结肠腺癌DLD1细胞24h后，与对照组相比，凋亡相关蛋白Cleaved Caspase－3的表达随着药物浓度的增加而明显的增高（图3）。

图3 NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞Cleaved Caspase－3的表达的影响

2.4 自噬抑制剂3－MA增加了NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞增殖的影响

5mM的3－MA和（或）100nM的PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235作用人结肠腺癌DLD1细胞24h后，与对照组相比，3－MA组细胞的生存率没有受到明显的影响，而3－MA和NVPBEZ235的联合组细胞的生存率明显被抑制，且细胞的生存率明显的低于单加NVP－BEZ235组（图4）。

图4 抑制自噬剂增加NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞增殖的抑制

2.5 自噬抑制剂3－MA促进了NVP－BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞的凋亡

AnnexinV／PI染色后流式细胞术结果分析，自噬抑制剂3－MA增加了PI3K／mTOR抑制剂对人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的影响。5mM的3－MA和（或）100nM的PI3K／mTOR抑制剂NVPBEZ235作用人结肠腺癌DLD1细胞24h后，与对照组相比，单加3－MA组细胞凋亡率无明显差异；而3－MA和NVP－BEZ235联合应用组细胞的凋亡率显著高于单加NVP－BEZ235组（图5）。

图5 抑制自噬剂增加NVP－BEZ235引起的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡

2.6 3－MA影响了NVP－BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡相关蛋白的表达

5mM的3－MA和（或）100nM的PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235处理24h后，与对照组相比，3－MA组凋亡相关蛋白的表达无明显变化；与单加NVP－BEZ235组比较，3－MA和NVPBEZ235联合组Cleaved Caspase－3蛋白的表达水平明显增加，且差异有统计学意义（图6）。

图6 抑制自噬剂增加NVP－BEZ235引起的人结肠腺癌DLD1细胞Cleaved Caspase－3表达

3 讨论

目前，结直肠癌的发病率和死亡率仍不断升高，已成为了世界上最常见的恶性肿瘤之一，而随着人们生活方式和饮食习惯的改变，其发病率居我国恶性肿瘤的第3位，并且每年仍有不断增加的趋势。PI3K／Akt是一种主要的存活通路，在许多癌症中都发挥重要的作用，包括结直肠癌［9］。通过靶向PI3K／Akt／mTOR通路在结直肠癌中已被广泛的研究。这条通路也是和化疗药物耐受相关［10］。NVP－BEZ235是一种新的并有前景的PI3K／mTOR抑制剂，它能有效的抑制PI3K和mTOR的活性。最近的研究展示，NVP－BEZ235能够对PI3K3CA突变和未突变的结直肠癌都有效［11］。因此，NVPBEZ235很快成为了治疗结直肠癌的很有前景的药物。在我们的研究中，发现PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235以剂量依赖的方式有效的抑制人结肠腺癌DLD1细胞的增殖，并诱导细胞发生凋亡。

大量的研究展示，在癌症细胞中，PI3K／Akt／mTOR通路的抑制能够有效的诱导自噬的发生［12］。报道称，mTOR通过它的下游基因ULK的磷酸化而成为自噬主要的调控［13］。所以mTOR的抑制能够有效的诱导自噬的发生。通过PI3K／Akt／mTOR通路诱导的自噬的发生在一些研究中已经被发现与细胞死亡的机制有关，然而也有一些研究展示在药物耐受中，自噬发挥了保护性的作用。在结直肠癌中，自噬发挥了保护性的作用［14］。因此在癌症细胞中，抑制自噬能够有效的增强PI3K／mTOR抑制剂的促凋亡效应。在我们的研究中展示，自噬抑制剂3－MA和PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235联合应用时，能够明显的增强NVPBEZ235的细胞毒性，诱导人结肠腺癌DLD1细胞发生凋亡，并增加凋亡相关蛋白Cleaved Caspase－3的表达。

因此，PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235作为治疗癌症有前景的药物，能够有效地诱导人结肠腺癌DLD1细胞发生凋亡，但是目前其诱导的自噬对癌症细胞起到了一定的保护作用。加入自噬抑制剂3－MA能够有效的增强NVP－BEZ235对人结肠腺癌DLD1细胞的杀伤作用，进一步的提高了人结肠腺癌DLD1对NVP－BEZ235的敏感性。因此，自噬抑制剂3－MA和PI3K／mTOR抑制剂NVPBEZ235的联合应用成为治疗结直肠癌的潜在有效的治疗方案，其临床疗效值得进一步研究。

［1］Xu AG，Yu ZJ，Jiang B，et al.Colorectal cancer in Guangdong Province of China：a demographic and anatomic survey［J］.World J Gastroenterol，2010，16（8）：960.

［2］Ades S.Adjuvant chemotherapy for colon cancer in the elderly：moving from evidence to practice［J］.Oncology（Williston Park），2009，23（2）：162.

［3］Li H，Jin X，Zhang Z，et al.Inhibition of autophagy enhances apoptosis induced by the PI3K／AKT／mTor inhibitor NVP－BEZ235 in renal cell carcinoma cells［J］.Cell biochemistry and function，2013，31（5）：427.

［4］Vivanco I，Sawyers CL.The phosphatidylinositol 3－Kinase AKT pathway in human cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2：489.

［5］Luo J，Manning BD，Cantley LC.Targeting the PI3K－Akt pathway in human cancer：rationale and promise［J］.Cancer Cell，2003，4：257.

［6］Chang Z，Shi G，Jin J，et al.Dual PI3K／mTOR inhibitor NVPBEZ235－induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cell lines is enhanced by inhibitors of autophagy［J］.International journal of molecular medicine，2013，31（6）：1449.

［7］Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease［J］.Cell，2008，132：27.

［8］Rubinsztein DC，Gestwicki JE，Murphy LO，et al.Potential therapeutic applications of autophagy［J］.Nat Rev Drug Discov，2007，6：304.

［9］Chen J.Potential value and limitation of dual inhibitors of PI3K and mTOR in the treatment of cancer［J］.Curr Cancer Drug Targets，2013，13（2）：117.

［10］Brognard J，Clark AS，Ni Y，et al.Akt／protein kinase B is constitutively active in non－small cell lung cancer cells and promotes cellular survival and resistance to chemotherapy and radiation［J］.Cancer Res，2001，61（10）：3986.

［11］Roper J，Richardson MP，Wang WV，et al.The dual PI3K／mTOR inhibitor NVP－BEZ－235induces tumor regression in a genetically engineered mouse model of PIK3CA wild－type colorectal cancer［J］.PLoS One，2011，6（9）：e25132.

［12］Mirzoeva OK，Hann B，Hom YK，et al.Autophagy suppression promotes apoptotic cell death in response to inhibition of the PI3K－mTOR pathway in pancreatic adenocarcinoma［J］.J Mol Med，2011，89：877.

［13］Jung CH，Jun CB，Ro SH，et al.ULK－Atg13－FIP200complexes mediate mTOR signaling to the autophagy machinery［J］.Mol Biol Cell，2009，20：1992.

［14］Wu S，Wang X，Chen J，et al.Autophagy of cancer stem cells is involved with chemoresistance of colon cancer cells［J］.Biochemical and biophysical research communications，2013，434（4）：898.

Inhibition of autophagy enhances dual PI3K／mTOR inhibitor NVP－BEZ235induced apoptosis of human colon adenocarci－noma cell lines

SIQINGTUNALA
.（Erdos Central Hospital of Inner Mongolia，Erdos 017000，China）

ObjectiveTo investigate effects of inhibition of autophagy on NVP－BEZ235－induced apoptosis in human colon adenocarcinoma cell line DLD1.Methods After the DLD1cells were treated with NVP－BEZ235and／or 3－MA，cell viability was detected by an MTT assay.The rate of cell apoptosis was detected using flow cytometry.The expression of apoptosis－related protein were detected by Western blot.Results The cells were treated with varied concentration of NVP－BEZ235for 24h.According to the results of MTT and flow cytometry，the rate of cell proliferation decreased，and the rate of cell apoptosis increased in the dose of NVP－BEZ235.Meanwhile，the expression of apoptosis－related protein，cleaved caspase 3，was increased.However，after autophagy was inhibited by 3－MA，the rate of cell viability was obviously decreased.Meanwhlie，we detected that inhibition of autophagy enhanced the rate of NVP－BEZ235－induced apoptosis and the expression of apoptosis－related protein were obviously increased.Conclusion Autophagy protected human colon adenocarcinoma cell line DLD1from NVP－BEZ235－induced apoptosis.In addition，the blockage of autophagy could enhance NVP－BEZ235－induced apoptosis.The combined therapy of NVP－BEZ235and 3－MA may be a promising therapeutic strategy for human colon adenocarcinoma cell line DLD1.

autophagy；dual PI3K／mTOR inhibitor NVP－BEZ235；3－MA；Apoptosis；human colon adenocarcinoma cell

R735.3＋5

A

斯庆图娜拉（1979－），女，蒙古族，鄂尔多斯市中心医院，博士，研究方向：消化内科学。

2015－03－03）

1007－4287（2015）10－1632－04