高蛋氨酸饮食对大鼠血管平滑肌细胞作用的实验研究

陈立杰，常明秀，靳京美，曹 月，王 锐，张雪梅

（1.哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科，黑龙江哈尔滨150081；2.哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科；3.大庆龙南医院内科）

高蛋氨酸饮食对大鼠血管平滑肌细胞作用的实验研究

陈立杰1＊，常明秀2，靳京美3，曹 月1，王 锐1，张雪梅1

（1.哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科，黑龙江哈尔滨150081；2.哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科；3.大庆龙南医院内科）

目的研究高蛋氨酸（Methionine，Met）饮食对大鼠血浆同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）和硫腺苷同型半胱氨酸（S－adenosylhomocysteine，SAH）浓度及颈动脉血管平滑肌细胞的影响，同时观察叶酸、维生素B12对其血管损害的保护作用。方法 选取Wistar雄性大鼠21只，随机分为三组：对照组给予正常饲料，高蛋氨酸组给予添加1%高蛋氨酸的饲料；干扰组给予1%高蛋氨酸同时添加叶酸、维生素B12饲料。饲喂动物10周后留取腹主动脉血检测Hcy、SAH浓度，留取颈总动脉标本行HE染色，并计算平滑肌厚度指数（Smooth muscle thickness index，SMTI）。结果 高蛋氨酸组大鼠血浆Hcy水平较对照组及干扰组明显增高（P＜0.05），血浆SAH水平较对照组明显下降（P＜0.05），SMTI较对照组及干扰组明显增高（P＜0.05）。结论 高蛋氨酸饮食对Wistar雄性大鼠具有毒性作用，能引起血浆Hcy水平升高，SAH水平下降，引起动脉平滑肌损伤，并且这种血管损伤可能是由于血浆Hcy水平增高所致。叶酸、维生素B12具有拮抗高蛋氨酸饮食所致的高Hcy血症，对血管损伤具有一定的保护作用。

蛋氨酸；同型半胱氨酸；硫腺苷同型半胱氨酸；血管平滑肌细胞

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1622）

通过饮食摄入的过量蛋氨酸进入机体后可通过蛋氨酸循环转化生成血浆同型半胱氨酸（Hcy），此前多项研究认为Hcy是一种具有神经毒性的物质，是脑血管闭塞性疾病的独立危险因素［1］，因此，高蛋氨酸饮食具有血管损害作用，但是目前关于其致病的确切机制尚无定论。而近年来有研究显示血浆Hcy的前体物质硫腺苷同型半胱氨酸（SAH）可通过诱导整体基因低甲基化或个别基因高甲基化等方式造成血管平滑肌损害，导致动脉粥样硬化，而Hcy介导的血管损害可能是由于SAH的蓄积所致［2］。本研究旨在通过大鼠血浆SAH和Hcy的测定及血浆叶酸、维生素B12水平的测定，观察脑动脉血管平滑肌厚度的变化，进一步明确高蛋氨酸饮食导致的脑动脉损害过程中Hcy及SAH所具有的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组与处理

选取Wistar雄性大鼠21只进行适应性喂养1周后称重，然后随机分为三组分笼喂养，每组7只。对照组：饲喂普通大鼠饲料；高蛋氨酸组：在标准饲料中加入1%高蛋氨酸；干扰组：在高蛋氨酸组基础上加入0.003%叶酸以及0.00002%维生素B12，均喂养10周，定期称重，实验期满时行腹主动脉采血5ml于含有EDTA抗凝剂的采血管中，3 000r／min离心10－15min，血浆冻存于－80°冰箱中，成批测定血浆Hcy及血浆SAH浓度指标。分离的颈总动脉于冰冻PBS溶液中漂洗数秒钟后用OCT包埋剂进行包埋，将包埋盒立即放入液氮罐中冷冻保存。

1.2 血Hcy及SAH浓度测定

应用雅培i2000化学发光仪（购自美国雅培公司）测定大鼠血浆Hcy浓度，大鼠血浆硫腺苷同型半胱氨酸测定的ELISA试剂盒（购自上海江莱生物科技有限公司）测定血浆SAH浓度。

1.3 颈总动脉HE染色

将颈动脉置于冰冻切片机上行冰冻切片，片厚为8μm，后行HE染色，100倍光镜下照相、观察，并计算SMTI。

1.4 实验数据的分析与统计

所有数据统计学分析及图形的制作均应用GraphPad Prism软件，计量资料平均值均用x—±s表示，数据统计应用统计学软件SPSS 17.0进行正态分布检验方差齐性检验及方差分析，以P＜0.05认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 实验期间大鼠临床表现

实验期间，3组大鼠体重逐渐增加，未见因发生其他疾病而死亡的大鼠。其中对照组发育良好，表现正常，摄食饮水量正常，精神状态良好；高蛋氨酸组大鼠反应减慢，活动迟钝，摄食及饮水量较对照组略少，7周后偶有大鼠出现行走不稳；干扰组精神状态好，对声音刺激敏感，运动异常活跃，摄食及饮水量较对照组及高蛋氨酸组略多，偶有精神过度紧张。

2.2 血浆Hcy及SAH浓度测定

结果见表1。

表1 血浆Hcy和SAH浓度

表1 血浆Hcy和SAH浓度

注：a：与对照组比较P＜0.05；b：与高蛋氨酸组相比P＜0.05。

组别血浆Hcy浓度血浆SAH浓度n（mol／L）（ng／L）μ对照组7 14.97±2.16 92.41±5.14高蛋氨酸组7 26.07±7.63a75.60±6.23a干扰组7 16.55±2.25b84.46±11.15

2.3 动脉血管的病理学观察

2.3.1 HE染色结果（×100倍放大） 见图1。

图1 动脉血管HE染色结果

2.3.2 动脉血管平滑肌相对厚度测定及动脉平滑肌厚度指数（Smooth muscle thickness index，SMTI）

动脉平滑肌厚度指数（SMTI）＝动脉平滑肌细胞相对厚度（mm）／体重（g）。

实验期满时三组大鼠平均体重为：对照组（g）：501.07±27.01，高蛋氨酸组（g）：456.14±28.99，干扰组（g）：504.43±30.83。

表2 动脉平滑肌厚度及SMT

表2 动脉平滑肌厚度及SMT

注：a与对照组比较P＜0.05；b与高蛋氨酸组比较P＜0.05。

组别n厚度（μm）SMTI（μm／g）7 32.04±2.87 0.0642±0.0075高蛋氨酸组7 39.43±6.38a0.0865±0.0134a干扰组7 34.65±3.38 0.0670±0.0072对照组b

3 讨论

3.1 高蛋氨酸饮食的毒性作用

研究指出给予高蛋氨酸饮食的哺乳动物可以表现明显的神经毒性症状［1］，本实验结果显示高蛋氨酸组大鼠体重减轻，精神状态，反应速度均较正常对照组减弱，活动量少，偶有出现肢体力弱，走路偏斜，考虑为高蛋氨酸饮食所致神经系统中毒作用，给予叶酸及维生素B12干扰后的大鼠摄食饮水量及体重较对照组及高蛋氨酸组均增加，精神状态良好，对声音光线刺激敏感，说明叶酸、维生素B12具有拮抗这种毒性损害的作用。这与以往研究观察结果相同，也支持关于Hcy具有神经血管损害作用的理论［3，4］。

3.2 Hcy与动脉血管平滑肌细胞

摄入体内的高蛋氨酸主要进入蛋氨酸循环，通过代谢转化生成Hcy，此前多项研究指出血Hcy浓度的过度增高可以通过损伤血管或者其他多种作用机制导致脑血管疾病的发生。由于Hcy水平增高仍普遍被认为是一种损害性氨基酸，目前临床上已将其视为脑血管疾病重要危险因素而定量筛查。在本实验中高蛋氨酸组动物血Hcy水平较对照组明显增高、血SAH水平下降，伴有VSMCs排列混乱，动脉平滑肌厚度指数增加，说明高蛋氨酸饮食可能通过增加Hcy浓度促进VSMCs增殖，从而对血管产生毒性作用。有关机制研究指出血Hcy水平增加可以通过介导脂肪因子抵抗，从而导致VSMCs增加，说明Hcy与VSMCs增殖具有相关关系［5］。还有研究指出高Hcy可以抑制内皮细胞生长来促进血管平滑肌细胞增殖［6］。因此，Hcy对脑血管疾病的风险预测具有一定意义。此外，许多研究认为Hcy水平增高可能是多种阻塞性心脏疾病、痴呆、神经退行性疾病的危险因素。Hcy在各种疾病之间是否存在交互作用，以及Hcy是否是通过直接抑或非直接作用于血管引起的病理生理损伤仍待进一步研究。

3.3 SAH与动脉血管平滑肌细胞

虽然体内甲基化反应的直接供体是硫腺苷蛋氨酸，但是，由于SAH与硫腺苷蛋氨酸所依赖的甲基转移酶催化区具有更高的亲和力，SAH可通过改变甲基转移酶催化区的结构从而抑制其活性，进而引起DNA低甲基化从而损伤血管［7，8］。本实验中在高蛋氨酸组血Hcy浓度较对照组明显增高的同时，表现出VSMCs损害，却伴有SAH水平降低，这与此前研究的结果有所不同［9，10］。对此我们推测：由于正常机体蛋氨酸循环中Hcy向SAH的转化是应处于一个动态平衡中，且多基于体内Hcy水平严重增高的基础之上，而在本实验中可能由于高蛋氨酸组血浆Hcy升高的程度有限，未出现重度高Hcy血症，血Hcy向SAH转化减少，而SAH被消耗生成腺苷的反应未见减弱甚至增强所致。限于本研究的样本数较少，其确切机制尚有待于进一步深入研究。

3.4 叶酸、维生素B12对血Hcy和SAH的影响及血管损害的保护作用

此前研究认为叶酸、B族维生素可通过降低血Hcy水平，改善高Hcy血症所致的血管损伤，近年有报道指出受孕母体中血维生素B12水平缺乏、Hcy水平增高与神经管损害有关，因此人们推测增加叶酸、维生素B12及其他富含甲基饮食可降低血Hcy水平，减少受孕后的神经管损害从而起到良性作用［11］。2011年Pizzolo F也指出叶酸可以干预升高的血Hcy水平，但对整体基因甲基化水平则可能无效［12］。最近的研究指出高剂量的叶酸可能通过降低血Hcy水平、增加BH4和NO的含量而起到对血管内皮细胞的保护作用［13］。而本研究中发现在给予大鼠叶酸、维生素B12饮食干预后血Hcy浓度下降，SAH水平未见明显改变，同时其血管损害程度均较高蛋氨酸组明显减轻，说明叶酸及维生素B12可明显改善高蛋氨酸饮食所造成的血管损害，其机制可能是通过其降低Hcy水平所致，这与以往研究结果相同［10，14］。目前，关于SAH与脑血管疾病的相关关系，SAH对VSMCs以及动脉粥样硬化的真正作用机制尚无定论，仍有待于未来进行深入的研究证实。

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Experimental Study Of High Methionine Diet On Vascular Smooth Muscle Cells

CHEN Li－jie，CHANG Ming－xiu，JIN Jing－mei，et al.
（The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University Department of Neurology，Harbin 150081，China）

ObjectiveTo investigate the impact of High methionine diet on the concentration of Homocysteine（Hcy）and S－adenosylhomocysteine（SAH）and the carotid artery vascular smooth muscle cells in rats，observe the protective effect of folic acid and vitamin B12on the vascular damage.Methods 21male Wistar rats were selected，randomly divided into three groups：The control group received normal diet，the high methionine group were added 1% high methionine on the basis of normal diet，the intervention group adding folic acid and vitamin B12on the basis of the high methionine group.Feeding these diets for 10weeks，then collecting the abdominal aortic blood for detection the concentrations of Hcy and SAH，isolating the carotid artery for HE staining and calculating the smooth muscle thickness index（SMTI）.Results The concentration of homocysteine in the high methionine group was significantly higher than the control group and the intervention group（P＜0.05），the SAH level was significantly reduced contrary to the control group（P＜0.05），SMTI was significantly higher than the control group and the intervention group（P＜0.05）.Conclusion High methionine diet has a toxic effect on the male Wistar rats，it can lead to the elevated of Hcy concentration，the decreased of plasma SAH level and the damaged of vascular smooth muscle cell，besides，the elevated homocysteine level may be the reason that causes this vascular damage.Folic acid，vitamin B12have the effects that antagonist the hyperhomocystinemia which are leaded by the high methionine diet and has a protective effect on the vascular damage.

methionine；homocysteine；sulfur adenosine homocysteine；vascular smooth muscle cell

R543.4

A

陈立杰，女，主任医师、教授、博士，主要从事缺血性脑血管疾病的临床与基础研究。

2014－11－18）

1007－4287（2015）10－1622－04

黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目（12511266）

＊为通讯作者