柯萨奇病毒感染所致小鼠胰腺组织损伤

周 密，李 哲，王艳艳

（1.长春医学高等专科学校，吉林长春130031；2.吉林大学白求恩医学院；3.吉林大学第一医院儿科）

柯萨奇病毒感染所致小鼠胰腺组织损伤

周 密1，李 哲2，王艳艳3

（1.长春医学高等专科学校，吉林长春130031；2.吉林大学白求恩医学院；3.吉林大学第一医院儿科）

目的研究柯萨奇病毒感染与胰岛素依赖性糖尿病之间的关系。方法 采用人肠道病毒B组中柯萨奇B4病毒株感染小鼠，检测感染后小鼠胰腺组织病毒滴度、病理变化、糖耐量及胰岛素分泌情况。结果 病毒感染组小鼠胰腺组织病毒滴度比心肌组织和血清病毒滴度高，胰腺外分泌部破坏、胰岛萎缩；免疫组化分析显示胰岛素分泌量减少；小鼠糖耐量异常。结论 柯萨奇B4病毒感染可导致小鼠胰腺损伤，功能异常。

柯萨奇病毒；胰腺；胰岛素

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1615）

Ⅰ型糖尿病（Type 1diabetes mellitus，T1D）是由于胰腺分泌胰岛素的β细胞受损而导致的内分泌代谢疾病。近年研究表明，除遗传因素外，病毒感染等环境因素也是T1D发生的潜在致病因素。对相关问题的探讨已经成为研究I型糖尿病发病机制的热点［1］。病毒感染机制研究表明肠道病毒［2］感染，尤其是柯萨奇B组病毒（Coxsackievirus B，CVB）与I型糖尿病的发生密切相关［3，4］，国外的流行病学调查显示，在T1D患者中人类肠道病毒RNA的检出率高于未患糖尿病者［5，6］，并对分离自当地糖尿病患者的人类肠道病毒株进行实验研究，发现某些人类肠道病毒株（尤其是柯萨奇B组病毒）在体内外均能导致胰岛分泌功能障碍［3，4］。但由于人类肠道病毒的种类繁多，且致病谱广泛，尚不能确定哪些种类与T1D相关以及病毒在其中的作用机制。为进一步研究我国的柯萨奇B组病毒感染与T1D发生的关系，本研究采用我国流行CVB4株感染小鼠，并对感染小鼠血液及胰腺组织中病毒滴度、病理变化、糖耐量水平及胰岛素的变化进行动态观察，探讨柯萨奇病毒感染与I型糖尿病的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ICR小鼠，雄性，3－4wk龄，18－22 g，由吉林大学实验动物中心提供。

1.2 试剂 细胞营养液为美国Sigma产品；胰蛋白酶、新生牛血清为Hyclone产品；胰岛素抗体为BioChemicon产品，免疫组化试剂为福州迈新生物公司产品。血糖检测试剂为中生北控生物科技股份有限公司产品。

1.3 细胞及病毒株 在Vero细胞上扩增柯萨奇B4病毒，滴定病毒的50%组织细胞感染量（TCID50／ml），按Reed－Muench法计算为10－7，细胞和病毒由吉林大学病原实验室保存。

1.4 实验动物病毒感染 小鼠随机分为感染组（1－6组）和对照组（1－6组），每组10只，饲养条件一致。感染组每只腹腔注射0.2ml病毒液（4×100TCID50CVB4），对照组每只腹腔注射0.2ml生理盐水。分别在感染后不同时间（1、4、8、15、30及60d）处死小鼠，无菌条件分离胰腺、心脏，取血液，分别用于病毒滴度、血糖及病理变化的动态观察。

1.5 病毒滴度的检测 感染后不同时间取小鼠血液，分离胰腺及心肌组织并称重，将组织碎块置无菌离心管制成悬液，反复冻融，4℃高速离心后取上清液及血清分别进行系列稀释，接种单层Vero细胞96孔板，测定胰腺、心肌组织及血清中病毒的TCID50／g（ml）。细胞病变的观察采用光学显微镜（奥林巴斯CKX41）进行。

1.6 病理及免疫组化分析 感染后不同时间取小鼠胰腺及心肌组织用常规方法固定、浸蜡及包埋，切片HE染色，光镜观察。按照SP法免疫组化试剂盒说明，用胰岛素抗体对小鼠胰腺切片进行免疫组化分析，观察胰岛素在小鼠胰腺组织的表达情况及部位。

1.7 糖耐量测定 感染病毒后60d，感染组和对照组小鼠各10只，禁食8小时，分别取血液，按血糖试剂盒说明操作，测定空腹血糖值（即0min血糖值），然后小鼠按2mg／kg体重的剂量，每只腹腔注射30%葡萄糖溶液。分别在给糖后10、30、60和120 min测血糖值，记录血糖变化，进行统计学分析并绘图。

1.8 统计学分析 对感染组和对照组血糖值的统计分析采用配对t检验进行均数比较，数据用x—±s形式表示，P＜0.05时差异具有显著性。

2 结果

2.1 血液、胰腺及心肌组织中病毒滴度变化 小鼠感染CVB4病毒后1d血液、胰腺及心肌组织中病毒的TCID50／g（ml）均值分别为10－7.5、10－4和10－5.8，病毒滴度在感染后4d达到高峰，胰腺组织中病毒滴度最高，之后逐渐下降，至感染15d后只有胰腺组织仍有病毒增殖（见图1）。结果表明该株CVB4对胰腺组织具有很强的亲嗜性，而在血液及心肌组织中只是短时间存在（8、15d）。

图1 感染组小鼠胰腺、心肌及血清中病毒滴度的变化

2.2 胰腺、心肌组织病理变化 感染组小鼠感染后8d、15d和30d的胰腺及心肌组织HE染色显示，8d时胰腺组织病理改变为急性胰腺炎，外分泌部腺泡细胞破坏，有大量淋巴细胞浸润，胰岛改变尚不明显（见图2－f）；心肌组织有少量淋巴细胞浸润（见图2－b）。15d时可见胰岛萎缩，已破坏的外分泌部由脂肪组织替代（见图2－g）；心肌组织少量充血水肿（见图2－c）。30d时胰腺外分泌部脂肪组织增生，胰岛萎缩（见图2－h）；心肌组织已修复为正常组织结构（见图2－d）。图2－a和图2－e为正常对照组心肌及胰腺。病理变化再次表明该病毒可在胰腺组织中大量增殖，并导致了严重的组织损伤，而在心肌组织中增殖较少，仅造成轻微炎症。

2.3 免疫组化分析 用胰岛素抗体进行免疫组化分析，感染8d时，胰岛分泌胰岛素的量与正常对照无明显差别（见图2－j，图2－i）；15d时胰岛内胰岛素的分泌比正常对照明显减少（见图2－k）；感染30d时，受损的胰岛结构中仅有少量胰岛素表达（见图2－l）。胰岛素表达的减少，说明由于胰腺组织的进行性破坏，使胰岛分泌胰岛素的功能受损。

2.4 糖耐量检测结果 感染60d时，与对照组相比，感染组小鼠注射30%葡萄糖后，0min（即空腹血糖）和10min血糖值无显著差异（P＞0.05）；而30min后各时间点血糖值均显著高于对照组（P＜0.05）（见图3）。可见，由于病毒的增殖，胰腺的结构破坏，导致功能受损，而使感染组小鼠清除血糖能力下降，表现为糖耐受不良。

3 讨论

本研究证实我国的CVB4流行株感染ICR小鼠，病毒在胰腺组织中滴度较高，持续增殖，并导致小鼠胰腺组织破坏，胰岛素分泌下降，糖耐量异常。本研究发现该株CVB4滴度的动态变化过程，感染后第4天病毒滴度在小鼠血液、心肌及胰腺中达高峰，而一周后仅胰腺组织有病毒复制，说明病毒对小鼠胰腺组织有很强的亲嗜性，这可能与介导柯萨奇病毒感染的受体，即柯萨奇病毒－腺病毒受体（CAR）的组织表达量有关［7］。研究中还发现在病毒感染的早期（即病毒大量增殖期），胰腺组织病理检查表现为急性炎症，胰腺组织结构破坏严重，而病毒增殖较少的心肌组织则仅表现为轻微炎症，这一方面是由于病毒的复制增殖造成了胰腺组织直接损伤，另一方面机体对大量病毒抗原的免疫应答也间接地造成了胰腺的免疫病理损伤。另外，随感染时间延长，发现受损的胰腺组织没有像心肌组织一样逐渐修复，而是被大量的脂肪组织所替代，胰岛萎缩，残存胰岛减少。

图2 小鼠心肌、胰腺HE染色病理切片（a－h）光镜照片（×200）；感染后小鼠胰腺免疫组化切片（i－l）光镜照片（×400）

图3 感染60 d小鼠糖耐量检测结果

为进一步研究感染小鼠胰腺功能变化，对胰腺组织采用胰岛素抗体进行免疫组化分析，结果表明残存胰岛的胰岛素分泌逐渐减少，说明胰岛的功能受损。此后对感染小鼠糖耐量的检测，也发现其对糖的清除能力明显低于正常对照组，本研究胰岛素和糖耐量的检测结果与国内的相关研究一致［8］。其原因首先是由于病毒的增殖直接或间接地破坏了胰腺组织，造成其功能障碍；其次胰腺外分泌部的严重破坏导致其中的胰岛再生细胞减少，影响了胰岛的损伤修复和再生［9］，使有功能胰岛的数量减少；另外本研究中还发现，胰岛的炎症反应虽比外分泌部轻微，但其功能却受到很大影响，这是由于病毒可能以胰岛素颗粒为载体来复制子代病毒，在复制增殖过程中影响了胰岛素分泌和运输［4］，表现为胰岛β细胞分泌功能进一步下降。总之，该病毒的感染破坏了小鼠胰腺的组织结构，导致胰岛素分泌减少，小鼠表现为糖耐量异常，说明该株病毒可能具有潜在的致糖尿病性。

肠道病毒属于小RNA病毒，其基因组极易变异，加之地域差异，即使在同一血清型内部也存在着广泛的多态性，具有不同的致病特性，其中与糖尿病发生相关的病毒种类及其作用机制尚处于研究阶段。本研究的结果为明确肠道病毒感染与胰岛素依赖性糖尿病关系及其作用机制提供了可借鉴的实验数据，将有助于糖尿病病因学研究的进一步开展。

［1］Nielsen D，Krych L，Buschard K，et al.Beyond genetics，Influence of dietary factors and gut microbiota on type 1diabetes［J］.FEBS Letters，2014，588：4234.

［2］Yeung W，Rawlinson W，Craig M.Enterovirus infection and type 1diabetes mellitus：systematic review and meta－analysis of observational molecular studies［J］.BMJ，2011，342：d35.

［3］Dotta F，Censini S，van Halteren A.Coxsackie B4virus infection of cells and natural killer cell insulitis in recent－onset type 1diabetic patients［J］.PNAS，2007，104（12）：5115.

［4］Hodik M，Lukinius A，Korsgren O，et al.Tropism analysis of two Coxsackie B5strains reveals virus growth in human primary pancreatic islets but not in exocrine cell clusters in vitro［J］.Open Virology Journal，2013，7：49.

［5］Oikarinen M，Tauriainen S，Oikarinen S，et al.Type 1diabetes is associated with enterovirus infection in gut mucosa［J］.Diabetes，2012，61：687.

［6］Dahlquist G，Forsberg J，Hagenfeldt L，et al.Increased prevalence of enteroviral RNA in blood spots from newborn children who later developed type I diabetes［J］.Diabetes Care，2004，27：285.

［7］Bergelson J，Cunningham J，Droguett G，et al.Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2and 5［J］.Science，1997，275（5304）：1320.

［8］石艳春，李 凡，黄红兰.柯萨奇B4病毒体内外感染所致小鼠胰岛B细胞的损伤［J］.内蒙古医学院学报，2000，22（1）：1.

［9］Yap I，Giddings G，Pocock E，et al.Lack of islet neogenesis plays a key role in beta－cell depletion in mice infected with a diabetogenic variant of coxsackievirus B4［J］.J Gen Virol，2003，84（11）：3051.

Mice pancreatic tissue damage induced by Coxsackievirus infection

HOU Mi，LI Zhe，WANG Yan－yan.
（Changchun MedicalCollege，Changchun130031，China）

ObjectiveStudy the association between Coxsackievirus infection and T1Donset.Methods Infect mice with CVB4strain which belongs to Human Enterovirus B group.Test the virus titre，pathological changes，glucose tolerance，and insulin secretion assays of the pancreatic tissues after infection.Results The virus titre of the pancreatic tissues was higher than that of the cardiac muscle tissues or the serum.Exocrine pancreas were damaged.Islands of pancreas were depauperated.Immunohistochemcial assays of pancreatic tissue indicated insulin secretory volume reduction.The glucose tolerance of the mouse was abnormality.Conclusion Damage and disfunction of the mouse pancreatic tissue can be induced by CVB4infection.

Coxsackievirus；pancreatic tissue；insulin

R373.2＋3

A

周密（1966－），女，博士，教授，吉林省高校新世纪科学技术优秀人才，主要从事分子病毒学研究。

2015－01－16）

1007－4287（2015）10－1615－04

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目资助（2013540）