人源Tau蛋白截短片段转基因果蝇模型的建立

耿俊华

摘要：人Tau蛋白是一种主要的细胞骨架蛋白，由Tau蛋白组成的神经纤维缠结是阿尔茨海默病的两大病理特征之一，C末端缺失的Tau已经证实是神经纤维缠结的组份之一，体内体外实验已经证实，Tau蛋白可以是多种蛋白酶的水解底物。但是，Tau蛋白水解产生的截短片段在阿尔茨海默病中的作用目前还不清楚。为了能够在在体水平研究Tau蛋白截短片段的毒性机制，将Tau蛋白截短成不同的截短片段：Taul-44、Tau45-441、Tau45-230、Tau231-441 利用显微注射的方法构建Tau基因截短片段的转基因果蝇，并利用果蝇中的UAS/GAL4系统驱动截短的Tau蛋白片段在果蝇的眼睛中异位表达，该实验结果发现在果蝇眼睛中过表达Tau蛋白截短片段并没有对果蝇眼睛的发育造成明显的毒性，从而推断Tau蛋白水解是机体的一种自我保护机制。关键词：阿尔茨海默病；Tau蛋白：转基因果蝇中图分类号：Q291

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2015）02-0095-05Establishment of Transgenic Drosophila Overexpressing the Truncated Fragments of Human TauGENG Jun-hua（The Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology， Ministry of Education， Beijing Normal University，Beijing 100875， China）Abstract：Human Tau is a microtubule-associated protein， which comprises intracellular neurofinrillary tan— gles（NFTs）， one of pathological features in Alzheimers disease （AD）. It has been reported that C-terminally truncated Tau is a constituent of NFTs. It also has been demonstrated that Tau can be hydrolyzed by different proteases in vivo and in vitro. But the roles of Tau fragments in AD are still unknown. To study the neurotoxicity of tau in vivo， different truncated fragments of tau gene including Tau 1-44，Tau45-441， Tau45-230 and Tau23 1-441 were constructed. These plasmids were microinjected to Drosophila to generate transgenic model of human truncated tau. Driven by UAS/GAL4 system， these different fragments of tau were eclopically expressed in Drosophila eyes， the results show that tau fragments dont have significant toxic to the development of Drosophila eyes， which suggests the hydrolysis of Tau protein as a self-protective mechanism of the organism.Key words： Alzheimers disease； Tau protein； transgenic Drosophila.（Life Science Research， 2015， 19（2）： 095?099）

阿尔茨海默病（Alzheimeis disease，AD）是一种神经退行性疾病，其主要病理的特征有：神经细胞内的神经元纤维缠结（NFTs）；神经细胞外的淀粉样斑块，又称老年斑（SP）；大量神经细胞的凋亡、丧失等[1]。NFTs的丰要组成成份即是Tau蛋白[2]，Tau蛋白参与到阿尔茨海默病的作用机制日前还不清楚。

在阿尔茨海默氏症病人的脑脊液中存在Tau蛋白的截短片段[3、4]。体外实验也证明Tau蛋白的水解产物参与到细胞的凋亡过程中。Park等用Aβ处理AD小鼠的原代培养神经元，可以激活神经元细胞中的Calpain，水解Tau产生17kD的Tau蛋白片段，并诱导原代培养神经元细胞的凋亡[5]。Amadoro等将Tau蛋白截短成大小不同的截短片段，并把这些片段转染到小脑颗粒细胞中，用MTT的方法证实了Tau蛋白的一些截短片段对细胞具有毒性作用，并认为这种毒性作用是通过NMDA受体来介导的[6]。

为了能够在在体水平阐述Tau蛋白截短片段的毒性机制，我们选用果蝇作为模式生物，依据Tau蛋白潜在的Calpain水解位点将Tau蛋白截短成不同的截短片段[6、7]：Tau1-44、Tau45-441、Tau45-230和Tau231-441，构建Tau基因截短的转基因果蝇，利用UAS/Gal4系统特异性地将Tau蛋白的截短片段表达在果蝇眼睛中，观察Tau蛋白截短片段对果蝇眼睛发育的影响。1材料与方法1.1实验材料

W1118果蝇和pGMR-CAL4A果蝇；大肠杆菌DH15α；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶等购自大连TaKaRa公司；蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉等牛化试剂购自北京梦怡美生物公司；胶回收试剂盒购自杭州Axygen公司；质粒中抽提试剂盒购自德国Qiagen公司；PVDF膜（美国Millipore公司）、Western显色试剂（美国Millipore公司）、c-Myc单抗（美国Sigma公司）、Tau蛋白单抗5A6 （DSHB）和Tau蛋白的多抗H150（美国Santa Cruz公司）；引物合成和质粒测序由上海英骏生物技术有限公司完成。1.2实验方法1.2.1质粒的构建

用PCR的方法从T40质粒上分段扩增目的基因。PCR所用引物见表1，引物5'端加上了酶切位点和保护碱基，以便用于进行基因克隆（其中pUAST-taul-44的质粒由周洵提供）。

按产品说明书配制PCR反应液（组分详见产品说明书），并且按产品说明书方法设置PCR反应参数，如下：

1. 95℃，4 min

2. 95℃，0.5 min

3. 58℃，0.5 min

重复30个循环、

4. 72℃，1 min/kb

5. 72℃，10 min

6. 24℃，Hold

PCR反应结束后，用PCR同收试剂盒对PCR产物进行回收，并对PCR产物进行双酶切回收，使用T4 DNA连接酶将扩增片段克隆至载体pUAST中，再用热激法将连接后的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养，挑取菌落，提取质粒酶切鉴定并送公司测序。1.2.2显微注射

配制显微注射液（20 μL）：4×Injection Buffer5 μL；Helper DNA（△2-3），终浓度0.2 g/L；P因子载体，终浓度0.6 g/L；加ddH2O至20μL，显微注射缓冲液（5 mmol/LKCl，0.1 mmol/LNaH2PO4，pH6.8）。于显微注射前2d将100～200只W1118果蝇置于苹果培养基上开始适应，每天换2次培养基，直至注射前30 min换上一块新鲜的苹果培养基平板，收集这段时间W1118果蝇产的卵，用50%的漂水去除卵壳，洗净，将卵呈线性排列，并且注意所有卵头尾方向一致硅胶干燥8 min，在倒置显微镜下将灌好显微注射液的注射针插入处理后的果蝇卵尾端极细胞处（将来要发育成果蝇生殖腺的部位）。将注射后的果蝇卵放在琼脂培养基卜，放置于温度为25℃湿度为60%～70%的环境中24～36h，等待幼虫孵化。1.2.3转基因果蝇筛选、平衡及定位

将在24～36h之间挑幼虫，转移至果蝇玉米培养基，平均每40只幼虫放一个瓶子，置于25℃培养，这段时间幼虫逐渐结茧并羽化。及时挑出羽化的果蝇成虫雄蝇和雌蝇分别与W1118 品系的处女蝇和雄蝇按1：3的比例间交，置于25℃培养，约12d后可观察其子代，挑取红眼转基因果蝇。由于mini-white标记基因的表达可使W1118果蝇眼色从白变橘红，因此可以通过观察子代的眼色有没有变化，即可得知目的基因有没有整合入果蝇基因组且处于可表达的区域。得到的转基因果蝇品系必须经平衡、定位，便于品系的稳定保存及进一步研究。平衡、定位的具体操作步骤如图1所示。1.2.4 果蝇基因组DNA提取及转基因果蝇的PCR鉴定

每个转基因果蝇品系各取1只果蝇成虫置于-20℃处死，然后加200 μL溶液A，将果蝇成虫充分匀浆：65℃水浴30 min；加400μL溶液B，盖好管盖颠倒混匀数次（勿剧烈震荡），冰浴10 min；离心（12000g，15 min），收集约500μL上清至一新管；加300μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置2 min；离心（12000g，15min），弃上清；加70%乙醇1mL洗沉淀一次，弃上清，风干白色沉淀；加20μLddH2O溶解后用作PCR反应模板。

溶液A：100 mmol/LTris-HCl（pH 7.5），100mmol/L， EDTA（pH 8.0），100 mmol/L NaCl，0.5%（W/V）SDS；溶液B：1.437 5mol/L KOAc，2.275 mol/L Li-C1PCR反应体系及反应条件见1.2.1，待PCR反应终止，电泳检测。1.2.5果蝇杂交及果蝇眼睛总蛋白的提取将转基因果蝇品系与pGMR-GAL4品系交配，使Tau基因特异性地在果蝇的眼睛中表达。取果蝇头部约50个放入EP管中置冰上；加入100μL，RlPA buffer，在冰上将果蝇头部研磨至粉碎；离心（13000√min，4℃，15 min）后取上清60μL至一新管；在上述上清液中加入2μL 4×loading buffer，沸水浴8 min；离心，加样或4℃保存样品。Western-blot检测Tau蛋白的截短片段在果蝇眼部的表达情况，确定Tau蛋白的截短片段在果蝇眼部有表达后，再用扫描电子显微镜观察果蝇眼睛表型的变化情况。1.2.6扫描电镜观察果蝇眼睛表型取果蝇头部约20个立即放入4%戊二醛中4℃固定过夜，用PBST洗涤3次后，将样品分别置于30%、50%、70%、95%、100%乙醇中顺序脱水，每个步骤15 min，随后将样品干燥、镀金，用场发射扫描电镜（Hitachi SU70）观察果蝇眼睛表型。2实验结果2.1转基因果蝇质粒的构建本实验利用PCR的方法从T40质粒上分别扩增Tau基因的截短片段。为了能够方便Tau蛋白的检测，在质粒构建的过程中首先将编码人Tau蛋白截短片段的基因克隆到pCMV-Myc的载体中，再用PCR扩增的方法将myc标记连接到Tau蛋白截短片段的N端，将PCR的产物连接入pUAST载体中，凝胶电泳鉴定转基因果蝇质粒构建成功（图2）。pUAST-myc-tau45-230重组质粒的酶切鉴定电泳图1：DL15000；2：质粒pUAST酶切结果，作为阴性对照；3-6：泳道为质粒pUAST-myc-tau45-230酶切结果；7：DL2000（B） pUAST-myc-tau231-441重组质粒的酶切鉴定电泳图1：DL15000；2：质粒pUAST酶切结果，作为阴性对照；3-6：质粒pUAST-myc-tau231-441酶切结果；7：DL2000。（C）pUAST-myc-tau45-441。重组质粒的酶切鉴定电泳图1：DL15000；2：为质粒pUAST酶切结果，作为阴性对照；3-6：为质粒pUAST-myc-tau45-441酶切结果；7：DL2000。2.2人tau基因截短片段过表达转基因果蝇的建立

用显微注射的方法将带有目的片段的pUAST质粒注射到果蝇胚胎中。P因子的特征序列是载体pUAST的核心结构，它位于目的基因的上下游，转基因过程是在重组酶A2-3的帮助下完成，A2-3重组酶可以特异性地作用于P因子，将位于其内部的外源基因整合人果蝇基因组中，以达到构建转基因果蝇的目的。

将重组的含有Tau基因pUAST载体与Helper质粒（可表达重组酶A2-3）配制成显微注射液注射到果蝇胚胎中，并在其下一代中筛选转基因果蝇建系。当转基因果蝇平衡建系后，提取转基因果蝇基因组DNA作模板，PCR鉴定转基因果蝇的建立是否成功（图3）。2.3pGMR-GAL4驱动Tau基因截短片段的过表达

在果蝇眼部表达目的基因，如果目的蛋白对细胞有毒性，这种毒性作用会被放大到果蝇的整个复眼，果蝇的眼睛会变得粗糙，小眼的排列也变得杂乱无章[8]。这就是为什么在果蝇的过表达研究中，越来越多的人倾向于用pGMR-GAL4特异地驱动目的基因在果蝇眼睛中表达，以此来研究目的蛋白的毒性。本实验用pGMR-GALA驱动Tau基因截短片段在果蝇眼部特异性的表达，直观地观察Tau蛋白截短片段对果蝇发育过程的影响（图4）。本实验观察到GFP在果蝇眼睛中过表达对果蝇眼睛的发育没有毒性作用（图4B），Tau蛋白在果蝇眼睛中过表达对果蝇眼睛发育的毒性作用是Tau蛋白本身的特性，同时说明果蝇的眼睛为我们研究Tau蛋白的毒性提供一个很好的系统。扫描电镜的结果显示在果蝇眼睛中过表达Tau蛋白截短片段对果蝇眼睛的发育造成的毒性没有全长Tau蛋白的毒性明显。

随后，我们提取果蝇头部总蛋白，检测Tau蛋白在眼睛中的表达情况。Western blotting结果见图5，每种转基因果蝇都选择4株来验证目的蛋白的表达情况。但是，我们在蛋白水平没有检测到Taul-44的表达。3讨论

正向遗传学是将基因突变或缺失，使其功能丧失或减弱，观察基因突变对模式动物表型的影响，进而研究基因功能[9]。利用模式生物进行基因功能研究是一个非常有效的方法，果蝇作为模式动物在研究神经退行性疾病中关键蛋白的作用机制中也得到广泛的运用[10-12]。在果蝇、线虫和酵母中有约2/3的基因发生突变，却不能产生明显的表型改变[13]。这时，基因的异位表达可以帮助我们研究该基因的功能，如一些同源基因在果蝇中异位表达后可以造成明显的表型变化[14]。果蝇的UAS/GAL4系统由于其可以控制靶基因在一定的时空条件下高量表达，从而能够很好地确定特定的靶基因在特定的时空条件下对果蝇发育的影响[15]，因此果蝇已经成为一个理想的研究基因功能的工具。

在本实验中，我们成功构建4株Tau蛋白截短片段的转基因果蝇，利用pGMR-GAL4驱动Tau蛋白截短片段在果蝇的眼睛中特异性表达，随后观察Tau蛋白对果蝇眼睛发育的毒性。实验结果显示Tau蛋白截短片段对果蝇眼睛发育的毒性作用比全长Tau蛋白的毒性作用小。Amadoro等曾报道Taul-44介导了Tau蛋白对CGCs细胞的毒性[16]，而本实验中Taul-44对果蝇眼睛的发育没有毒性作用，我们认为Taul-44在不同的系统中表现出不同的蛋白性质，又或者Tau1-44对细胞的毒性作用有限，不能在果蝇的眼睛中表现出来，截短的Tau蛋白毒性在体内可能被掩盖起来了。Tau蛋白结构的完整性可能是Tau蛋白的毒性作用发挥的前提条件，而截短的Tau蛋白片段在果蝇体内并不能引起毒性作用。我们检测了Tau蛋白截短片段在果蝇的眼睛中的表达，发现除了Tau1-44，其他3个截短的Tau蛋白片段在果蝇眼睛中均有表达。之所以在蛋白水平没有检测到Taul-44，可能是因为Taul-44表达后不稳定，在细胞内容易被降解[6]。

在阿尔茨海默病中，Tau蛋白翻译后的修饰方式有很多种，除了Tau蛋白的水解，还有Tau蛋白的磷酸化[2、16]、糖基化[17-19]、泛素化[20、21]以及硝基化[22、23]等。Tau蛋白这些翻译后的修饰方式任何一种发生异常都可能会导致Tau蛋白获得某种毒性。本实验通过对过表达Tau蛋白截短片段的果蝇的分析，仅从一方面讨论了Tau蛋白在阿尔茨海默病中的作用，后续的实验可以进—步研究Tau蛋白各种翻译后修饰之间的关系，以及它们对Tau蛋白毒性的影响。参考文献（References）：[1]MOHANDAS E， RAJMOHAN V， RAGHUNATH B. Neurohiology of Alzheimers disease[J]. Indian Journal of Psychiatry，2009，51（1）： 55-61.[2]AVILA J. Tau phosphorylation and aggregation in Alzheimer's disease pathology [J]. FEBS Letters， 2006，580（12）： 2922-2927.[3]GARCIA-SIERRA F， WISCHIK C M， HARRINGTON C R， el al. Accumulation of C-terminally truncated tau protein associated with vulnerability of the perforant pathway in early stages of neurofibrillary pathology in Alzheimer's disease[J]. Journal of Chemical Neuroanatomy， 2001，22（1-2）： 65-77.[4]MCMILLAN P J， KRAEMER B C， ROBINSON L， el al. Truncation of tau at E391 promotes earLy pathologic changes in transgenic mice[J]. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology， 2011，70（11）： 1006-1019.[5]PARK S Y， FERREIRA A. The generation of a 17 kDa neurotoxic fragment： an alternative mechanism by which tau mediates beta-amyloid-induced neurodegenerationf[J]. The Journal of Neuroscience， 2005，25（22）： 5365-5375.[6]AMADORO G， CIOTTI M T， COSTANZI M， et at. NMDA receptor mediates tau-induced neurotoxicity by calpain and ERK/MAPK activation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（8）： 2892-2897.[7]JOHNSON G V， JOPE R S， BINDER L I. Proteolysis of tau by calpain[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1989，163（3）： 1505-1511.'[8]COOK T， ZELHOF A， MISHRA M， et al. 800 facets of retinal degeneration[J]. Progress in Molecular Biology and Translational Science，2011，100：331-368.[9]JAISWAL M， SANDOVAL H， ZHANG K， et al. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophild[J]. Annual Review of Genetics，2012.46： 371-396.[10]温艾，刘力.以果蝇模型研究人类神经退行性疾病[J].生物化学与生物物理进展（WEN Ai， LIU Li. Drosophila as a model to study human neurodegenerative diseases[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics），2003，30（3）：357-362.[11]PRUSSING K， VOIGT A， SCHULZ J B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease[J]. Molecular Neurodegeneration，2013，8（1）：35.[12]WHTMANN C W， WSZOLEK M F， SHULMAN J M， et al. Tauopathy in Drosophila： Neurodegeneration Without Neurofihrillary Tangles[J].Science，2001，293（5530）： 711-714.[13]徐人宏.任婧，徐荣.等.SNKIA转基因果蝇的构建[J].复旦学报（自然料学版）（XU Tian-hong， REN Qian， XU Rong， et al. Construction of SNFIA Gene Transgenic Flies[J]. Journal of Fudan University （Natural Science）），2003，42（1）：98-102.[14]SKIM1YA M， GEHRING W J. The Drosophila homeobox gene optix is capable of inducing ectopic eyes by an eyeless-independent mechanism[J]. Development，2000，127（9）： 1879-1886.[15]DHELPS C B， BRAND A H. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system[J]. Methods， 1998，14（4）： 367- 379.[16]ALONSO A D， GRUNDKE-IQBAL I，BARRA H S， et al. Abnormal phosphorylation of tau and the mechanism of Alzheimer neurofibrillary degeneration： sequestration of niicrotubule-as-sotiated proteins 1 and 2 and the disassembly of microtubules by the almoimaltau[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（1）：298-303.[17]SMET-NOCCA C， BRONCEL M， WIERUSZESKI J M，et al. Identification of 0-GlcNAc sites within peptides of the Tau protein and their impact on phosphorylation[J]. Molecular BioSys-tems， 2011，7（5）： 1420-1429.[18]LIU F， ZAIDI T， IQBAL K， et al. Aberrant glycosylation modulates phosphorylation of tau by protein kinase A and dephos-phorylation of tau by protein phosphatase 2A and 5[J]. Neuro-science， 2002，115（3）： 829-837.[19]LIU Y， LIU F， IQBAL K， et. al. Decreased glucose transporters correlate to abnormal hyperphosphorylation of tau in Alzheimer disease[J].FEBS Letters，2008，582（2）： 359-364.[20]DAVID D C， LAYFIELD R， SERPELL L， et al. Proteasomal degradation of tau protein[J]. Journal of neurochemistry， 2002，83（1）：176-185.[21]DE VRIJ F M， SLUIJS J A， GREGORI L， et al. Mutant uhiquitin expressed in Alzheimer s disease causes neuronal death[J].Federation of American Societies for Experimental Biology，2001，15（14）：2680-2688.[22] REYNOLDS M R， BERRY R W， BINDER L I. Site-specific nitration and oxidative dityrosine bridging of the tau protein by peroxynitrite： implications for Alzheimers disease[J]. Biochemistry，2005，44（5）：1690-1700.[23]REYNOLDS M R， REYES J F， FU Y， et al. Tau nitration occurs at tyrosine 29 in the fibrillar lesions of Alzheimers disease and other tauopathies[J]. The Journal of Neuroscience， 2006，26（42）： 10636-10645.