ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化模型的建立

欧海龙 张礼林 何晓兰 李红梅 雷霆雯

摘要：ApoE-/-基因敲除小鼠（ApoE-/-）经含有21%脂肪和0.15%胆固醇的高脂饲料喂食12周后进行各项血脂胆固醇水平检测，以及整体主动脉油红0染色与主动脉根部病理切片油红0染色等动脉粥样硬化病理分析。结果显示经过高脂诱导的ApoE-/-小鼠的血浆总胆固醇和甘油三酯水平均比未经饮食诱导的ApoE-/-小鼠、经同样饮食处理的野生型小鼠以及未经处理的野生型小鼠均显著升高（P<0.05）；低密度脂蛋白-胆固醇水平与野生型（正常饮食组和高脂组）相比升高了近3倍多；高脂诱导ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积占整体主动脉面积的65%，显著高于ApoE-/-小鼠的正常饮食组（21%）（P<0.05），同时主动脉根部的血管壁明显增厚，管腔变窄。实验结果表明通过高脂饲料饮食诱导，成功建立了动脉粥样硬化模型小鼠，可为下游的药物筛选、基因治疗以及动脉粥样硬化机理的体内研究提供理想的实验材料。关键词：ApoE-/- 小鼠；动脉粥样硬化；胆固醇；血脂；主动脉中图分类号：R394 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0141-04The Establishment of Atherosclerosis Model in ApoE-/- MiceOU Hai-long， ZHANG Li-lin，HE Xiao-lan， LI Hong-mei， LEI Ting-wen（Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guiyang Medical University， Guiyang 550004， Guizhou， China）Abstract ： The ApoE gene knockout mice （ApoE-/-） were fed with a high-fat （HF） diet containing 21% fat and 0.15% cholesterol for 12 weeks to establish atherosclerosis model. After diet induction， the ApoE-/- mice were sacrificed and plasma total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low -density lipoprotein -cholesterol （LDI-C） and high-density lipoprotein-cholesterol （HDL-C） levels were measured. The whole aortas and sequential sections of the aortic root were stained with oil red 0. Results showed that the plasma levels of TC and TG from HF diet induced ApoE-/- mice were both dramatically higher than normal diet（ND）-fed ApoE-/- mice as well as wild-type mice fed with normal diet or HF diet （P <0.05）. The contents of LDL-cholesterol in plasma were elevated by three-fold compared with wild-type （ND and HFD）. Atherosclerotic lesion sizes were significantly increased in whole aorta （65%） as compared with normal diet ApoE-/-mice （21%）. Similar result was obtained from cross -sections of the aortic root analysis. The results demonstrated that HF diet treatment greatly enhanced atherosclerosis development in ApoE-/-mice. The establishment of atherosclerosis model mice provides a valuable tool for drug screen， gene therapy and even in vivo mechanism analysis in atherosclerosis disease.Key words ： ApoE-/-mice； atherosclerosis； cholesterol； lipoprotein； aorta（Life Science Research， 2015， 19（2）：141 ?144）体内的脂类物质代谢异常时，多余的脂质沉积在血管壁上，并逐渐形成斑块，使血管内皮增厚、变硬，是引起动脉粥样硬化（atherosclerosis AS）的重要原因之一。载脂蛋白E（apo；ipoprotein E，apoE） 主要存在于乳糜微粒（chylomicrom，CM）、极低密度脂蛋白（verylowdesitylipoprotein，LDL）等多种血浆脂蛋白中，可介导脂蛋白残粒的摄取，维持血浆胆固醇的平衡、促进泡沫细胞中胆固醇的外流以及具有抗氧化和消炎等作用，该基因缺陷将使体内脂代谢发生紊乱。ApoE基因敲除的纯合小鼠（ApoE-/-）可正常存活和繁殖，当给予适当的高脂饮食时，可导致各种高脂蛋白血症[1.2]，是动脉硬化研究的常用工具。本研究以C57BL/6纯系的ApoE-/-小鼠为材料，通过高脂饲料喂养，成功诱导其形成动脉粥样硬化病变小鼠模型，该模型可为下游的药物筛选、基因治疗以及动脉粥样硬化机理的体内研究提供理想的试验材料。1材料与方法1.1试剂和仪器体视显微镜（江南永新，南京），倒置显微镜（TS100F，Nikon公司，日本），冰冻切片机（CM1850，Leica公司，德国）；小鼠基础饲料由贵阳医学院动物中心提供；尹红、苏木素购自北京赛弛生物公司；油红0购自北京鼎国生物公司；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒购自南京建成生物公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2试验动物C57BL/6纯系背景的载脂蛋白E基因敲除小鼠（ApoE-/-）购自南京大学模式动物研究所，引种协议[2012]470号。动物饲养环境条件为室温20-25℃，相对湿度40%～70%。对6周龄左右的雄性（ApoE-/-小鼠（n=8）进行高脂肪饲料喂养（21%脂肪和0.15%胆固醇），喂食12周之后，对体重为25?30g的小鼠进行解剖并抽取静脉血用于下一步实验。1.3血脂水平的检测方法血清总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三月脂（Triglyceride，TG）水平的测定分别采用胆固醇氧化酶法（C0D-PAP）及磷酸甘油氧化酶法（GP0-PAP），最后通过分光光度计在500nm测得吸收值。低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定方法均按照南京建成试剂盒说明书进行操作。1.4主动脉整体染色方法小鼠采血后，在麻醉下用PBS进行灌注，分离获得整体主动脉，清除其余脂肪和结缔组织后，用PBS清洗干净，于4%多聚甲醛中固定12h以上，再纵向剖开。主动脉经70%乙醇中浸泡2min后进行油红0染色30min（用异丙醇配成0.5%的母液，再以3：2的比例稀释成工作液）；70%乙醇漂洗至组织发白，经蒸馏水清洗数次后拍照，并用Image-Pro Plus 6.0.（IPP6.0）软件（Media Cybernetics）对斑块面积进行定量分析。1.5主动脉根部斑块组织化学分析方法取出心脏固定48h后，从心耳下方切取主动脉根部，再进行蔗糖脱水，0CT（Optimal cutting temperature compound）包埋。快速冷冻之后从主动脉瓣开始以100μm为间距切取连续5张厚度为8μm的切片。切片进行油红0染色。染色方法同1.4。1.6统计方法实验结果的数据均表达为均数±标准差。各组数据之间显著性检验用多个样本均数比较及两两比较的t检验分析。2结果2.1 血脂检测ApoE-/-小鼠在高脂饲料饮食诱导12周后，取静脉血进行TC、TG、LDL-C和HDL-C水平检测。结果显示经高脂诱导小鼠的TC和TG含量比未经诱导的野生型和ApoE-/--小鼠，以及经高脂诱导的野生型小鼠均显著升高（P<0.05）（表1），其中比未经诱导ApoE-/-小鼠的TC含量提高了50%。高脂组ApoE-/-小鼠的LDL-C水平比其他三组对照小鼠也存在不同程度的提高，特别是与野生型（正常饮食组和高脂组）相比升高了近3倍多；HDL在体内具有抗动脉粥样硬化作用，其水平与正常饮食的ApoE-/-小鼠相比有显著升高，但与野生型（正常饮食组和高脂组）相比变化相对较小（表1）。2.2动脉粥样硬化的病理分析对实验小鼠进行解剖，获取主动脉，通过油红0染色的方法确定脂质在整体主动脉壁上的积累程度，结果发现经高脂饲料饮食诱导后ApoE-/-小鼠的主动脉弓、腹主动脉、胸主动脉以及髂总动脉分支处均可见明显的粥样硬化斑块，斑块内的脂质被油红0染成红色，其阳性比例高达65%，比未经诱导处理的同窝出生的小鼠（21%）显著升高（P<0.05）（图1）。同时，获取主动脉根部，经冷冻切片后进行油红0染色。我们发现结果与整体主动脉染色的相似，在经高脂饲料饮食诱导后小鼠中，其主动脉根部的血管壁明显增厚，红色脂质沉积在管壁面上，使管腔狭窄，而未经处理的ApoE-/--小鼠的斑块面积占动脉总面积的比例相对较小（图2）。3讨论小鼠对胆固醇表现出比人类更强的耐受力，发生动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的进程和病变好发部位与人类也均有一定的差异，所以曾一度被认为不适合作为动脉粥样硬化研究的模式动物[3.4]。后来人们发现C57BL/6背景的小鼠品系对胆间醇相对较为敏感，特别是Piedrahita等在1992年成功制备出的C57BL/6背景的ApoE基因敲除小鼠，当其给予高脂饮食，较易诱发AS而且病变进程与人类的相似，可发展至平滑肌细胞浸润等中晚期粥样病变[5.6]。再加上小鼠本身易于繁殖，饲养成本较低等优点，使ApoE-/-小鼠取代之前常用的兔、大鼠、猪等动物，成为近年来进行AS研究的主要模式动物。在20世纪60年代，人们采用30%脂肪、5%胆固醇和2%的胆汁酸成功诱导出C57BL/6的AS小鼠，但是该饲料对小鼠不是很健康，易使小鼠体重减轻、并发呼吸系统感染等炎症反应。1985年Paigen等对上述饲料进行了改进，发明了“Paigen饲料”包括15%脂肪、1.25%胆固醇和0.5%的胆汁酸，降低了原饲料的毒性，并取得不错的诱导效果[7]。之后人们在上述饲料的基础上对其成分和比例进行再次调整，制备出了更为健康的饲料（21%脂肪和0.15%胆固醇），由于与美国人的饮食习惯较为接近，被称为“西方型”词料。本研究中我们采用该饲料对ApoE-/-小鼠进行诱导，发现经过3个月的诱导后，高脂诱导小鼠的TC含量比未经诱导ApoE-/-小鼠上升了50%；LDL-C水平与野生型相（正常饮食组和高脂组）相比升高了近3倍多。主动脉斑块面积占整体主动脉的面积比提高了近60%，AS病变效果显著。该小鼠可为AS的多方面研究提供实验动物模型：药物筛选；分子干预，如基因治疗等；以及AS相关的病理机制研究，比如分析在AS病变下的生理特征、相关基因表达谱的改变等。主动脉整体染色可以非常直观地反应出AS的病变程度，是AS研究中常用的一种分析手段，但在具体操作细节上根据不同的实验材料稍有差异。有的研究者在获取小鼠整体主动脉之后不进行甲醛固定或纵向切开后再进行固定[8]。本实验则采用立即固定的方法，主要是由于小鼠动脉管比较嫩，固定后就会变得坚韧，这有利于血管外周粘附着丰富的脂肪以及血管的剖开等操作。染色之后，在观察主动脉并拍照时，人们通常利用细针将经纵向切开后的血管固定在蜡板上，使其展现出内膜，这在大动物上较易操作。小鼠主动脉较细，通过细针展现内膜的方法不好操作；本研究将剖开后的血管贴在透明胶布上，实验证明该方法可以很方便地将血管平面展开，内膜暴露，而不必借助于细针。主动脉根部是小鼠AS病变的好发部位，对该位置的病理分析已成为小鼠AS程度评价的一个主要指标。在对主动脉根部进行切片制作时，我们认为取材最为关键。解剖获得心脏之后，在紧贴心脏处，垂直于动脉瓣的方向切断升主动脉，保证使3个动脉瓣处于同一平面上。接着包埋、切片，由于考虑到后期要进行油红0染色，因此本实验采取冷冻切片。切下的片子先不染色，在体视显微镜下观察切面情况，当出现主动脉瓣结构时，正式贴片、染色[9.10]。总之，本研究用含有21%脂肪和0.15%胆固醇的高脂饲料诱导ApoE-/-小鼠，经12周的饮食处理后，血浆总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白指标明显升高，而且主动脉斑块显著增多，主动脉根部管壁增厚，表现出典型的动脉粥样硬化病理特征。该小鼠可用于下一步的药物干预和病理机制的研究。参考文献（References）：[l]PLUMP A S， SMITH J D， HAYEK T， et al. 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