TRAF4的结构与生物学功能

王沂 赵俊睐 韩晓燕 王洋

摘要：TRAF（TN1？ receptor associated factor）家族蛋白是一类具有相同C末端保守结构域的细胞内接头蛋白，能够与包括TNF受体在内的多种受体蛋白相互作用传递信号并因此得名，目前已经发现了7种TRAF家族蛋 白TRAF4是TRAF家族蛋白中最古老的成员之一，最早在乳腺癌的转移淋巴结中发现，在多种实体肿瘤组织中存在高表达和亚细胞定位的异常。与其他TRAF家族蛋白主要参与免疫和炎症反应不同，TRAF4在免疫中的作用非常有限，目前其已知功能主要体现在胚胎发育、细胞极性、凋亡以及活性氧生成调节等方面。 关键词：TRAF4；胚胎发育；细胞极性；凋亡；活性氧中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0169-07Structure and Biological Function of TRAF4WANG Yi1， ZHAO Jun-jian1， HAN Xiao-yan1， WANG Yang2*（1. Department of Clinical Laboratory， Affiliated Hospital of Hebei Union University， Tangshan 063000， Hebei， China；2. College of Life Sciences， Hebei Union University， Tangs han 063000， Hebei， China）Abstract：TRAFs （TNF receptor associated factors）， a family of intracellular adaptor proteins with the same conserved C—terminal domain， can interact with a wide range of cell surface receptors including TNFR as signal transducers. Presently， 7 TRAFs have been identified in humans. TRAF4， one of the most primitive members of TRAF family， was originally identified from metastatic lymph nodes of breast cancer patients. Later sludies showed that the overexpression and altered subcellular localization of TRAF4 could be detected in many kinds of solid tumors. TRAF4 plays a limited role in immunity， which is different from other TRAF family members. At present， it is known that TRAF4 mainly functions in regulating embryonic development， cell polarity， apoptosis and generation of reactive oxygen.Key words ：TRAF4； embryonic development； cell polarity； apoptosis； reactive oxygen species

（Life Science Research，2015，19（2）：169?175） TRAF（TNF receptor associated factor）家族蛋白是一类具有相同C末端保守结构域的细胞内接头蛋内，最早被发现能够介导肿瘤坏死因子受体（TOKK）家族的细胞内信号转导并因此得名，但后来的研究发现TRAF蛋白还能够与包括Toll样受体（TLR）家族、IL-1受体家族以及视黄酸诱导基因蛋白I（RIG-I）样受体家族在内的多种受体蛋白相互作用并传递信号，目前已经在哺乳动物中发现了7种TRAF蛋白。TRAF家族蛋白通过对细胞生存、增殖、分化和凋亡的调控，广泛参勹包括免疫、胚胎发育、应激反应等多种生物学过程并在其中发挥着重要的作用[1]。TRAF4是TRAF家族蛋白中比较特殊的一个，本文对TRAF4的结构和功能做一综述。 1TRAF4蛋白的结构和_般性状人类TRAF4基因编码一个470aa组成、相对分子质量54kD的衔接蛋白，在胞浆、细胞核以及细胞膜上均有定位。TRAF4蛋白主要包含3个结构域，从N端到C端依次为一个RING-finger结构域、7个连续的锌指结构域、1个TRAF结构域。其中TRAF结构域是TRAF家族蛋白的特征性结构，除了TRAF7，所有的TRAF蛋白家族成员都包含一个C末端TRAF结构域。按照结构和功能的不同，TRAF结构域又可以被分为TRAF-N和TRAF-C两部分，其中TRAF-N部分由多个a螺旋组成，在不同TRAF家族成员中保守性较差[2]；而TRAF-N部分序列高度保守，折叠形成一个8链β-三明治结构，又被称作MATH（meprinandTRAF-homology）结构域，主要介导TRAF蛋白的三聚化以及作为与信号分子直接或间接结合的位点（图1）。三聚化的TRAF蛋白形成蘑菇样结构，3段TRAF-N结构域的α-螺旋平行排列在一起形成的卷曲螺旋结构，构成蘑菇样结构的柄，TRAF-C构成蘑蓝样结构的伞盖（图2）。相比于其他TRAF家族成员，TRAF4的TRAF-N结构域要更短，仅由3个7肽重复区构成，而其他TRAF家族成员至少由10个以h7肽重复区构成。这就造成TRAF4蛋白与其他TRAF蛋白的结合能力很弱[3-5]。除TRAF1蛋白外，所有的TRAF家族成员都包含一个位于N末端的RING-finger结构域以及几个连续的锌指结构域。TRAF4的RING-finger结构域为两个锌指结构组成的C3HC3D型模体。RING-finger结构域在泛素途径中具有重要的作用，能够将泛素酶与其底物蛋白相连，发挥类似E3连接酶的作用[6]。3个富含半胱氨酸的CART结构域（与RING-finger结构域和TRAF结构域相关的富含半胱氨酸结构域（cysteine rich domain associatedwithRINGandTHAFdomain）位于RING-finger结构域和TRAF结构域之间，每一个CART结构域均由一个外显子编码，包含两个HC3HC3锌指模体。TRAF4是唯一具有3个CART结构域的TRAF家族成员，TRAF4也因此结构域曾被命名为CART1。后来的研究显示，这段富含半胱氨酸区域共由7个锌指模体构成，其中前6个锌指模体为C2HC型，而第7个为C2H2型。在N端第一个CART结构域中存在1个核定位信号，此外，在RING-finger结构域N端的上游也存在1个核定位信号，TRAF4也是TKAF家族中唯一具有核定位信号的成员[3]。与TRAF蛋白家族的其他成员不同，TRAF4与包括TNFR1、TNFR2、Fas、CD40在内的大多数TNFR家族成员不存在直接的相互作用，与淋巴毒素β受体（LTβR）和神经生长因子受体（NGFR）仅存在微弱的相互作用，这种作用能够产生怎样的生理作用仍然未知，并且TRAF4的高表达并不能像TRAF2、TRAF5、TRAF6那样激活NF-kB[7]。TRAF4主要通过间接作用或形成复合体的方式在胞浆、胞膜和细胞核中迁移而发挥作用，其作用发挥涉及JNK、ERK、PI3K/Akt、Wnt等多条信号通路[8-11]，截至目前，JNK途径被认为是其中最重要的一条，TRAF4的大部分生物学效应伴随JNK途径的激活，但TRAF4单独激活JNK途径的能力很弱，必须与其他蛋白如MEKK4等结合之后才具有显著激活JNK途径的能力[12]。进化分析显示，TRAF1、2、3、5是在脊椎动物的进化过程中出现的，与TNFR家族形成于同一阶段，这一结果说明此4种TRAF家族蛋白的功能与TNFR家族蛋白的功能是相关的。TRAF4和TKAF6住进化过程中出现较早，在低等的腔肠动物中即已发现TKAF4的同源类似物，并且无脊椎动物和脊椎动物的TRAF4同源蛋白在胚胎发育过程中都起着相似的作用[13]，据此推断TRAF4可能是TKAF家族中古老的成员之一，并且其发挥功能是TNKK非依赖的。2TRAF4与肿瘤TIUF4最早在乳腺癌患者的转移淋巴结中被鉴定出来[14]。之后的研究显示，除了乳腺癌，在包括肺癌、子宫癌、前列腺癌、结肠癌在内的多种肿瘤组织中都存在TRAF4蛋白的高表达，阳性率接近1/2，在肺癌中更是高达60%。并且TRAF4高表达只局限在肿瘤细胞中，周围的基质细胞则表达正常[15]。一项基于40个独立的基因芯片筛查实验的整合分析显示，67个基因的高表达可以作为肿瘤的特征性标记物，TRAF4即为其中之一[16]。并RTKAK4高表达的乳腺癌患者对化疗药物的敏感性降低，预后较差]I7L肿瘤中TRAF4蛋白的高表达常常伴随着亚细胞定位的异常。虽然TKAF4蛋白序列中存在两个可能的核定位信号，似内源性TKAF4的核定位目前仅在肿瘤细胞中发现在大多数正常细胞中，TRAF4主要以膜相关的形式定位，而在侵袭性肿瘤细胞中，TRAF4主要定位在胞桨中，此外，还有大约20%的TRAF4阳性肿瘤定位于细胞核中[15]。TRAF4的高表达和定位异常有可能成为肿瘤诊断的一个标志物，并且这种异常表达有可能参与肿瘤的发生。3TRAF4的生物学功能3.1TRAF4的生理表达及其在发育中的作用在成人几乎所有组织上皮的基底细胞层中都存在TKAK4蛋白的基础表达，并且各组织间表达水平差异不大[18]。在成年小鼠的各组织中也检测到了基础水平TRAF4的表达，但其中表达水平最高的部位是中枢神经系统的海马、嗅球以及小脑的浦肯野细胞[19]。在小鼠的胚胎中，TRAF4广泛表达在各个发育中的器官，其中中枢神经系统、外周神经系统和感觉器官的神经组织表达水平最高。TRAF4缺陷的纯合子小鼠显示出明显的上呼吸道缺陷，并导致约30%的小鼠在胚胎期死亡，幸存的TRAF4缺陷小鼠表现出典型的共济失调症状，并发生多种低渗透性改变，包括气管和中轴骨骼（胸骨、肋骨、尾骨）的严重畸形，以及导致轻度脊柱裂表裀产生的神经管闭合缺陷[19-21]。TRAF4表达在少突胶质细胞分化的每一个阶段，TRAF4敲除导致严重的中枢神经系统髓鞘不稳定和缺失：此外，TRAF4能够通过NgR/P75NTR/RhoA信号途径抑制肌动蛋白细胞骨架重排从而促进轴突再生和抑制神经细胞的凋亡，对神经元具有保护作用[22]。TRAF4在小鼠中枢神经系统中的表达是受到调控的，在小鼠出生后4周内，TRAF4的表达明显下调。在包括爪蟾、斑马鱼、果蝇在内的多种模式生物中，TRAF4均表现出类似小鼠的表达模式[23-26]。综上所述，TRAF4在大多数生物体内各器官广泛表达，但高表达于神经系统，对各系统发育，尤其是神经系统的发育起着不可或缺的作用TRAF4调控发育的机制目前尚未明了，有研究显示，TRAF4能够正向调控TGF-j8/BMP和TGF-0/nodal/activin信号途径，此两个途径均与胚胎的发育密切相关[24]。此外，还可能与TRAK4对细胞极性和凋亡的调控有关。3.2TRAF4与细胞极性TRAF4有多种不同的亚细胞定位，包括胞浆、细胞膜和细胞核。外源表达的TKAF4主要存在于细胞间接触点部位的细胞膜上。在体外培养的极化上皮细胞和正常人乳腺标本中，TKAF4与紧密连接的标志性蛋白共定位于细胞与细胞连接点上。荧光漂白恢复实验显示TRAF4与紧密连接的相关性是高度动态的，TRAF4在紧密连接和细胞浆间不断移位。这一结果说明TRAF4可能是正常上皮细胞间连接的信号传感器。与之相反的是，在分化差的卜.皮细胞肿瘤中，TRAF4或者弥漫性分布在胞浆中，或者在胞浆或胞核中呈现局灶性分布，提示这种细胞间信号转导功能可能被削弱气分节极性蛋白Armadillo是细胞间粘附的重要调节因子，也是Wnt途径重要的下游信号分子。在果蝇胚胎发育过程中，Armadillo与TRAF4发生直接的相互作用，以TNFR和JNK非依赖的方式精细调节中胚层细胞间粘合连接的形成[25]，在人类细胞中，可能存在类似的相互作用catenin是果蝇Armadillo在脊椎动物中的同源蛋白，最近的研究发现，TRAF4可以与β-catenin结合并影响β-catenin的亚细胞定位，高表达的TRAF4可以使β-catenin由胞浆进入细胞核，进而通过激活Wnt途径促进乳腺癌细胞的增殖TRAF4和0-catenin在脊椎动物胚胎发育中的作用机制目前尚无报道。TGF-yS信号途径是细胞极性的关键调节因素，参与上皮-间充质细胞的转化和肿瘤的发生，被看作是肿瘤治疗的一个潜在靶点。研究显示TRAF4在TGF-β诱导的SMAD和非SMAD途径中起着关键的作用。当TGF-β受体受到刺激的时候，TRAF4被活化的TGF-β受体复合物募集，拮抗E3泛素连接酶SMURF的作用（TRAF4作为SMURF2的主要E3连接酶，同时TRAF4本身可以作为SMURF1和SMURF2两种E3连接酶的底物）[24、27、28]，促进去泛素酶USP15向TGF-βI型受体（TβRI）的募集。这两个过程都能够促进TβRI在胞浆膜上的稳定性进而促进TGF-β信号途径。此外，TGF-β-TRAF4的相互作用可以激活Lys63相关的TRAF4多聚泛素化并激活TGF-β活化激酶（TAK1）及其下游的p38MAP激酶和NF-kB级联反应。敲除TRAF4可以引起E-cadherin的高表达并抑制细胞的迁移[29]。TRAF4对于TGF-0诱导的迁移、上皮间叶转化和乳腺癌转移起着关键的作用。最近的研究显示，TRAF4分子具有一个独特的磷脂酰肌醇结合结构域，通过与磷脂酰肌醇的相互作用，TRAF4负向调节紧密连接并促进细胞的迁移。TRAF4的高表达可能通过破坏紧密连接的稳定性和促进细胞迁移来促进乳腺癌的进程[30]。目前看来，对细胞极性的调控是TRAF4最为重要的生物学功能，明确TRAF4在细胞极性调控中的作用机制对于理解TRAF4在发育和肿瘤发生中的作用具有重要的意义。3.3TRAF4与凋亡TRAF4在凋亡中的作用存在两种截然相反的结论。例如，敲除TRAF4可以诱导浦肯野细胞发生凋亡[21]；TRAF4高表达可以使HEK293细胞抵抗anti-Fas抗体诱导的凋亡[31]；TRAF4敲除的MCF-7细胞被TNF-α刺激后，早期凋亡细胞比例明显增高[32]。其抗凋亡机制可能是TRAF4依赖其TRAF结构域与P53竞争性结合去泛素化酶HAUSP，从而抑制了P53的去泛素化，降低其稳定性[17]。另外的一些研究却显示TRAF4具有促进凋亡的能力。例如，在果蝇中，TRAF4的同源蛋白DTRAF1可以被果蝇TNF/TNFR同源物Eiger/Wengen的相互作用所募集，继而通过凋亡信号调节激酶1（ASK1）和JNK途径诱导果蝇细胞发生凋亡[33、34]；在体外培养的293T细胞中，TRAF4与神经生长因子受体P75NTR直接作用，抑制NF-KB的激活，诱导细胞发生凋亡[35]；在头颈部肿瘤中，TRAF4可以被P53家族成员（p63，p73，p53）正向调控；放射线诱导淋巴细胞凋亡和噪声诱导耳蜗细胞凋亡过程中都会出现TRAF4的高表达[38、39]；在多种不同来源的细胞系中，TRAF4的高表达可以诱导凋亡并且抑制集落形成，并且与P53的状态无关。这些看似矛盾的结果说明TRAF4在细胞生存、死亡的调控上具有细胞类型特异性。TRAF4对凋亡的调控很可能参与胚胎的发育和肿瘤的发生。3.4TRAF4与活性氧（ROS）的生成ROS是正常氧代谢的副产物，具有多种重要的生物学活性，包括参与杀菌、炎症反应以及内皮细胞的激活等。NADPH氧化酶2（NOX2）是NADPH氧化酶中分布最广的一个亚型，通过质膜传递电子给分子氧产生超氧化物，参与杀菌、炎症和上皮细胞的激活。P47phox是NOX2的一个胞浆内亚基，也是目前已知所有TRAF4结合蛋白中与TRAF4作用的机制最为明确的一个。研究证实，TNF-α能够诱导p47phox发生PKC依赖的磷酸化，TRAF4与磷酸化p47phox的C末端结合并携带p47phox向细胞膜转位，这种转位能够诱导JNK的激活，并引起NOX2的激活和ROS的产生[40]。GPIb-IX-V和GPVI是两种血小板糖蛋白受体，分别与血管性血友病因子（VWF）和胶原蛋白结合起始凝血过程。在血小板活化过程中都会产生大量的ROS，而ROS又会反过来调控血小板的活化，其机制未知。研究显示，TRAF4和p47phox可以作为GPIb-IX-V和GPVI的结合伴侣，GPIb-IX-V和GPVI的胞浆段与TRAF4的TR.AF结构域、p47phox的SH3结构域以及Hic-5形成一个复合体，从而使NOX2活化[41]。这一发现为解释氧化还原信号通路与血小板活化间的关系提供了一个合理的依据。3.5TRAF4与免疫TRAF家族是固有免疫信号通路中重要的接头蛋白，通过与TNFR和Toll/ILl受体家族成员作用，经NF-kB和MAPK的激活诱导免疫和炎症反应。但TRAF4似乎是一个例外，TRAF4缺陷的小鼠T/B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突细胞分化和功能均正常，仅表现为树突细胞的迁移能力降低[42]。TRAF4不能与大多数TNFR和TLR直接作用，TRAF4与不同的TLR成员共转染293T细胞会对TLR介导的NF-kB和IFN-β激活产生剂量依赖性抑制作用[43]，提示其对固有免疫发挥的是抑制作用。目前看来，TRAF4发挥免疫抑制作用主要与N0D2途径及其与TRAF6的相互作用相关。 N0D2（nucleotide-bindingoligomerizationdo-maincontaining2）是一种细胞内模式识别受体，在免疫平衡中起着重要的作用。N0D2在包括克罗恩氏病（节段性结肠炎）、Blau综合征等炎症性疾病的发病中起着重要的作用。有研究显示，TRAF4可能是N0D2途径的一个关键负调控子。TRAF4是IkB激酶α（IKKα）的底物，其Ser426可以被IKKα磷酸化，磷酸化的TRAF4能够与N0D2蛋白结合并抑制N0D2诱导的NF-kB激活及杀菌作用。Ser426位于TRAF4分子特有的一个膨大的β凸起中，其他的TRAF家族蛋白均无此结构，这也解释了在所有的TRAF家族蛋白中，仅TRAF4是对固有免疫起抑制作用[44、45]。 作为TRAF家族中另一位古老的成员，不同于TRAF4，TRAF6能够介导多种TNFR家族的信号转导，在固有免疫中发挥激活作用。实验显示，TRAF4可与TRAF6发生直接或间接的相互作用，拮抗TRAF6的生物学功能。早期的研究即已发现，TKAF4能够与p47phox协同，通过对抗TRAF6和β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）的作用而抑制TLR介导的信号转导[43]。新近的研究显示，TRAF4与TRAF6的对抗作用还体现在IL-17信号的转导中。TL-17是Th17细胞分泌的标志性细胞因子，IL-17与IL-17R结合后募集IL-17途径中两个关键信号分子肌动蛋白相关基因1（Actl）和TRAF6，形成IL-17R-Actl-TRAF6信号复合物，进而激活NF-kB和MAPK途径，促进炎症性细胞因子分泌，在多种炎症反应和自身免疫疾病的发病中起着重要作用。TRAF4和TRAF6在Acll上具有相同的结合位点，因而TRAF4可以与TRAF6竞争结合Act1，从而抑制IL-17信号转导。将野生型Thl7细胞转入TRAF4缺陷小鼠能够在极短的时间内诱导自身免疫性疾病的发生[46]。此外，TRAF4在免疫中的作用还与糖皮质激素诱导TNF受体（GITR）有关。GITR主要表达在T细胞、B细胞和巨噬细胞表面，TRAF4能够与GITR胞浆段发生间接作用，通过JNK途径增强GITR对NF-kB激活，拮抗抑制性T细胞的功能而促进辅助性T细胞的激活[47]。看起来TRAF4似乎对适应性免疫有一定的促进作用，但这一结论并未得到体内实验的支持。4总结与展望作为TRAF家族最古老的成员之一，有关TRAF4的研究却相对较少，TRAF4蛋白功能的认知仍然模糊。仅就目前的研究来看，大多数情况下，TKAF4与TNFH家族其他成员没有明显的直接作用或者作用很弱，主要通过间接作用或形成复合体的方式在胞浆、胞膜和细胞核中迁移而发挥作用，其作用发挥涉及JNK、ERK、P13K/Akt、Wnt等多条信号通路，但目前尚无法准确归纳出TRAF4在信号通路中的确切位置。多项有关TRAF4的研究出现了诸多矛盾的研究结果，例如对凋亡的影响、对NF-KB以及对某些信号途径的作用等，这充分说明TRAF4的生物学功能复杂而多样。作为一种衔接蛋白，鉴定其相互作用成分及作用机制将是揭示TOAF4神秘作用的关键。目前，已经鉴定出的TRAF4结合蛋白多达20余种，涉及膜受体、蛋白激酶、胞浆衔接蛋白、泛素途径相关酶、凋亡相关蛋白等（表1），其中很大一部分蛋白与TRAF4的互作机制尚未完全清楚，仍有待进一步研究。同时有理由相信，与TRAF4相互作用的成分并非仅仅以上20余种蛋白，以目前的技术水平，一些短暂的、低水平表达蛋白以及修饰蛋白相互作用及间接相互作用的鉴定仍然存在一定的闲难，并且与TRAF4作用的成分很可能并不局限于蛋白质。类似于转录因子的拼版理论，不同细胞内包含TRAF4作用成分的不同组合，导致TRAF4产生细胞特异的多样的生物学效应，这是造成TRAF4生物学效应复杂多样的最可能原因。分子间相互作用鉴定和定量技术的不断完善将会为TRAF4作用机制的研究提供有力支持。参考文献（References）：[1]DEMPSEY 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