不同载体上微量接触类检材的相关问题探究

董会 王晶 李彩霞 张涛 刘超

摘要：手部接触类生物物证是目前案件中的主要生物物证，但关于此类物证在不同载体上DNA的检出量和检验效果、最佳前处理方法以及检材放置不同时间后的检出量和检验效果的变化尚无详细研究报道通过制备手部接触类生物检材，分别使用直接剪取法、胶带粘取法、两步擦拭法和真空吸取法对检材进行前处理，然后进行DNA提取，用筛选出的最佳前处理方法处理放置不同时间段·的检材，均使用常规程序对检材进行DNA提取、定量和复合扩增，并对各项结果进行分析和讨论。实验观察到总体上使用直接剪取法进行前处理的检材提取到的DNA的量大于使用两步檫拭法和真空吸取法进行前处理提取到的DNA的量，且这4种前处理方法在不同载体的检材之间提取到的DNA量有差异；随着时间的推移，在放置360d内的DNA检出量和检验效果无较大差异；由此得出，不同载体上DNA的检出量和检验效果有差异，针对不同栽体，其最佳前处理方法也不同；检材常温干燥放置一年内，其DNA无明显降解。关键词：物证；接触类DNA；DNA分型；前处理方法；载体中图分类号：K89 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0145-09An Exploration on Trace Touch Related DNA Materials from Different SubstratesDONG Hui1， WANG Jing2， LI Cai-xia2，ZHANG Tao2，LIU Chao1*（1. Graduate School， Southern Medical University， Guangzhou 510515， Guangdong， China； 2. Institute of Forensic Science， Key Laboratory of Forensic Genetics， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China）Abstract ： Hand touch DNA material evidence is currently the main biological material evidence in the forensic cases. However， researches on the detection and inspection of DNA on different substrates， the best preprocess protocol and the change of the detection and inspection results of DNA on different substrates after placed at different times of these evidences have not been detailed investigated. DNA were extracted from mock exhibits after directly cutting method， wet and dry double swab technique， stubbing procedure and vacuum cleaner method. Then the best preprocess protocol was used to deal with the exhibits after placed at different times. DNA extracted from the samples was quantified and amplified using standard manufacture 1 s procedures， and the results were analyzed and discussed. The amount of DNA using direct cutting method for pretreatment was greater than the amount of DNA using the wet and dry double swab technique and the vacuum cleaner method for pretreatment. The four preprocess protocols show differences between different substrates. As time goes on， the amounts of DNA after placed various days had no significant differences. The detection， inspection of DNA and the best preprocess protocol on different substrates demon?strated clear differences. Under the normal temperature and dry conditions， the amounts of DNA detection in one year showed no degradation trends with time.Key words：biological evidence； touch DNA； DNA typing； preprocess method； substrate（Life Science Research， 2015，19（2）：145?153）微量接触类是目前检案中经常遇到的疑难生物物证，也是目前法医遗传领域的研究热点和难点之一[1、2].由于此类物证检验成功率低，往往需要反复多次检验而成为案件检验的限速步骤。微量接触类物证131是通过皮肤或粘膜接触而形成的一种物证，如刀柄、钥匙、手机、衣帽鞋袜、手套、门把手、果核、牙刷、饮料罐等客体上可能遗留有皮肤表皮脱落细胞或粘膜上皮细胞。伴随犯罪智能化水平的提高，血迹、毛发、精斑等明显的生物物证常常被有意识的破坏掉，而微量接触类物证由于量少不易被识别往往被忽略。此类潜在的生物物证由于只有少量脱落细胞或游离的DNA成份吒检验时很难判断载体上样本的具体部位，往往盲目剪取，剪取面积过大时又会降低DNA浓度或引入污染，但其检验结果往往可能成为案件侦破的关键线索和证据。目前关于接触类生物物证的相关研究和报道还很局限[5]，所以本实验针对此类生物物证，从物证的前处理方法人手，以手部接触类生物物证为研究对象，研究了不同载体的DNA检出量和检验效果有何不同、前处理方法对DNA检出量和检验效果的影响，以及放置不同时间后，DNA检出量和检验效果的变化。1材料与方法1.1实验材料普通棉线手套100只，粗棉质绳索（直径1cm、长8cm）30段，细棉质绳索（直径0.5cm、长8cm）30段，布片（4cmx4cm）30片，模拟门把手（木质，表面光滑附棕色油漆，直径2.5cm、长8cm）100个，玻璃片（2cmx7.5cm）60片，塑料绳索（8cm）30段，棉签100根，生物物证粘取器100个。塑料物证袋（15cmX20cm）100个，剪刀200把，镊子200个。1.2主要仪器和试剂AmpFLSTR?Identifiler?Plus试剂盒（Ap?pliedBiosystems公司，美国），M48QIAGEN?试剂盒（QIAGEN公司，德国），Thermomixercomfort（Eppendorf公司，德国），漩涡混合器（昊诺斯公司，中国），磁力架（Promega公司，中国），蛋白酶K（Merck公司，德国），Quantifiler?HumanDNAquantificationkit（AppliedBiosystems公司，美国），MastercyclerproEppendorf?热循环仪（Eppendorf公司，德国），ABI3130x1遗传分析仪（AppliedBiosystems公司，美国），7500Real-timePCRsys?tems（AppliedBiosystems公司，美国）。1.3方法1.3.1实验质量控制每次实验前，对实验材料和部分实验仪器用70%乙醇和0.05%的次氯酸进行浸泡或擦洗，在无菌的无纺布上进行干燥，并用紫外灯照射24h以上[6]。随机抽取5片布片、2段粗棉质绳索和2段细棉质绳索用直接剪取法[7]进行前处理，随机抽取2段塑料绳索用真空吸附法[8]进行前处理，随机抽取3只手套用胶带粘取法[9、10]进行前处理，随机抽取3个模拟门把手和5个玻璃片用两步擦拭法[11、12]，进行前处理，随机抽取10根棉签和5个塑料物证袋，然后对所有检材进行DNA提取、定量、扩增和毛细管电泳，检测结果均为阴性。1.3.2渗透性栽体的微量接触类DNA检材制备随机抽取8块布片随机分给实验无关个体8名（2名女性个体，6名男性个体），每个个体手部平均用力搓捏布片10s[13]，按2cmX2cm大小，剪为4片，随机3片分别采用直接剪取法、真空吸附法和胶带粘取法进行前处理。随机抽取8段粗棉质绳索随机分给实验无关个体8名（2名女性个体，6名男性个体），每个个体手部平均用力搓拉绳索10s，按每段2cm大小，剪为4段，随机3段分别采用直接剪取法、真空吸附法和胶带粘取法进行前处理。随机抽取8段细棉质绳索，随机分给实验无关个体8名（2名女性个体，6名男性个体），每个个体手部平均用力搓拉绳索10s，按每段2cm大小，剪为4段，随机3段分别采用直接剪取法、真空吸附法和胶带粘取法进行前处理。随机抽取24只手套随机分给实验无关个体8名（2名女性个体，6名男性个体），每个个体3只手套，每次每个个体用右手带一只手套且平均用力搓捏10s，对3只手套进行相同的检材制备过程，随机3只手套分别采用直接剪取法、真空吸附法和胶带粘取法进行前处理，其中3种前处理方法处理的部位均是手套的大鱼际和小鱼际处。每次检材制备时间间隔24h以上。1.3.3非渗透性载体的微量接触类DNA检材制备随机抽取8段塑料绳索随机分给实验无关个体8名（2名女性个体，6名男性个体），每个个体手部平均用力搓拉绳索10s，按每段2cm大小，剪为4段，随机分别采用直接剪取法、真空吸附法、两步擦拭法和胶带粘取法进行前处理。随机柚取24片玻璃随机分给实验无关个体8名（2名女性个体，6名男性个体），每个本3片玻璃，每次每个个体用右手平均用力按压玻璃10s，对3片玻璃进行相同的检材制备过程，随机3片玻璃分别采用两步擦拭法、真空吸附法和胶带粘取法进行前处理。随机抽取24个模拟门把手随机分给实验无关个体8名（2名女性个体，6名男性个体），每个个体3个模拟门把手，每次每个个体用右手平均用力搓捏模拟门把手10s，对3个模拟门把手进行相应的检材制备过程，随机3个模拟门把手分别采用两步擦拭法、真空吸附法和胶带粘取法进行前处理。每次检材制备时间间隔24h以上。1.3.4放置不同时间段的检材制备渗透性检材以手套为例，随机抽取40只手套随机分给实验无关个体5名（4名男性个体，1名女性个体）。每个个体8只手套，每次每个个体用右手带一只手套且平均用力搓捏30s，对8只手套进行相同的检材制备过程，随机8只手套分别放入8个塑料物证袋中，分别放置2d、6d、10d、30d、60d、90d、180d和360d后，然后采用真空吸附法进行前处理，其中前处理方法处理的部位均是手套的大鱼际和小鱼际处。每次检材制备时间间隔24h以上。非渗透性检材以模拟门把手为例，随机抽取40个模拟门把手随机分给实验无关个体5名（4名男性个体，1名女性个体），每个个体8个模拟门把手，每次每个个体平均用力搓捏模拟门把手30s，对8个模拟门把手进行相同的检材制备过程，随机8个模拟门把手分别放入8个塑料物证袋中，分别放置2d，6dJOd、30d、60d、90d、180d和360d后，然后采用真空吸附法进行前处理。每次检材制备时间间隔24h以上。1.3.5检材检验过程实验过程中，实验室温度保持为22～24℃，空气相对湿度为50%[7]。然后分别对已经进行前处现完毕的检材进行DNA提取，提取方法为磁珠法具体操作参照M48QIAGEN?试剂盒使用说明。用7500Real-TimePCRsystems和Quan-tifiler?HumanDNAquantificationkit对提取到的DNA全部进行定量。使用AmpFLSTR?Identi-filer?Plus试剂盒对DNA进行复合扩增，将1μL扩增产物和9μL甲酰胺内标混合物混合变性后，应用ABI3130XL型遗传分析仪进行电泳检测，用GeneMapperIDV3.3软件自动分析数据每组均设置空白试剂阴性对照和9947阳性对照甲酰胺内标混合物配比参照AmpFLSTR?Identi-filer?Plus试剂盒使用说明。1.3.6数据分析统计全部DNA定量结果，结果以质量的形式呈现。所得DNA检测图谱与巳知分型结果比对，以各等位基因峰高大于50RFUs者为有效分姻结果。平均等位基因数的计算为：平均等位基W数=有效分型结果总数/样本数。检测率的计算为：检测率=检测到的样本数/样本总数。用统计学方法中的Studentsttest[15、16]和One-WayANOVA[17]进行统计学运算。2结果2.1定量结果由于实验过程中存在无DNA、DNA童低于检测线，或者DNA损耗等各种因素，所以本研究假定实验中DNA损耗量为恒量在本实验中，所用的载体分为两种类型，其中棉线手套、布片和粗细棉质绳索均为渗透性载体，而模拟门把手、玻璃片和塑料绳索均为非渗透性载体，在渗透性和非渗透性载体的实验中所有模拟检材的DNA检测率为95.5%，其中渗透性载体上的DNA检测率为100%，非渗透性载体上的DNA检测率为90%，其中模拟门把手的DNA检测率为95.8%，玻璃片的DNA检测率为79.2%，塑料绳索的DNA检测率为93.8%。从实验数据可以得出，渗透性载体和非渗透性载体在用力搓拉1min后，用本实验所用到的4种前处理方法，95.5%以上的载体可以获得DNA，且DNA检测量均值为4.54ng，最小值为Ong，最大值为39.75ng。渗透性载体和非渗透性载体上的DNA检测量用Studentsttest相比有统计学差异（t=3.652，p=3.522E-4），其中渗透性载体的DNA检测量的均值为5.93ng（s=6.86），非渗遗性载体的DNA检测量的均值为2.87ng（s=4.13），从样本均数得出，渗透性载体的DNA检测非渗透性载体的DNA检测量。在不同的载体上DNA检出量之间有差异，其中手套与细棉质绳索、模拟门把手、玻璃片和塑料绳索之间均有差异，从样本均数得出，手套上的DNA检测量大于细棉质绳索、模拟门把手、玻璃片和塑料绳索上的DNA检测量。在无统计学差异的载体之间，其样本均数及标准差仍有较大不同，详见表1、表2和图1。从表1的实际数据可以看出，渗透性载体的DNA检测量的均值明显高于非渗透性载体，其中玻璃片的DNA检测率和DNA检测量均值均为最低，由此得出，在玻璃片上不易遗留DNA。在表2中，载体之间通过统计学运算，两两之间比较的统计学差异有部分显著，而部分并不显著，这是由于微量接触类检材中DNA检测量普遍较低，数据通过统计学比较差异并不十分明显，但其DNA检测量均数和标准差同样能反映不同载体之间的不同。从图1上可以明显看出，棉线手套和布片检测到的DNA量明显高于玻璃片和塑料绳索检测到的DNA量，从表2可以看出，这种差异有明显的统计学意义。从样本均数看，DNA检测量多少为：棉线手套>布片>粗棉质绳索>模拟门把手>细棉质绳索>塑料绳索>玻璃片。图1中可以明显看出DNA检测量的变化，同时，也清晰地展示了7种不同载体的DNA检测量的变化范围情况，由图1可知，DNA检测量较高的载体，其变化范围较大，而DNA检测量较低的载体，其DNA检测量普遍较低，变化范围相对较小。在模拟样本检材的制备时，选取了6名男性个体和2名女性个体，这8个不同无关个体在DNA检测量上的不同有统计学意义，其均值分布详见图2。从图2可以看出，8名个体之间大体无明显差异，根据统计学运算，8名个体用One-WayANOVA两两之间相互比较有差异（F=5.479，P=1.096E-5），主要差异表现在个体5与其他7名个体之间，从样本均数看，个体5的DNA检测量大于其他个体，详见表2。实验中，4种前处理方法进行处理后的DNA检测率不同。其中，使用直接剪取法进行前处理获得的DNA检测率为100%，使用胶带粘取法进行前处理获得的DNA检测率为94.6%，使用真空吸附法进行前处理获得的DNA检测率为94.6%，使用两步擦拭法进行前处理获得的DNA检测率为91.7%。不同载体使用不同的前处理方法进行处理后进行DNA提取，这4种前处理方法在处理相同载体时获得的DNA检测量并不相同，且在一些载体获得的DNA检测量上存在明显差异，例如实验中，使用3种前处理方法处理布片，应用One-WayANOVA进行统计学分析（F=4.362，P=0.026），其统计学差异主要表现在使用直接剪取法与真空吸附法进行前处理获得的DNA检测量之间，从样本均数看，使用直接剪取法进行前处理获得的DNA检测量明显大于使用真空吸附法进行前处理获得的DNA检测量。在4种前处理方法处理其他载体时，部分载体在这些前处理方法之间无明显统计学差异，但其均值却有明显不同，在棉线手套中，使用真空吸附法进行前处理获得的DNA检测量明显较大；在布片中，使用直接剪取法进行前处理获得的DNA检测量明显较大；在粗棉质绳索中，3种前处理方法获得的DNA检测量均值大小均较接近，以使用胶带粘取法进行前处理获得的DNA检测量较高；在细棉质绳索中，使用直接剪取法和胶带粘取法进行前处理获得的DNA检测量明显高于使用真空吸附法前处理获得的DNA检测量；在模拟门把手中，使用真空吸附法和胶带粘取法进行前处理获得的DNA检测量高于使用两步擦拭法进行前处理获得的DNA检测量；在玻璃片中，3种前处理方法获得的DNA检测量均值大小均较接近，以使用真空吸附法进行前处理获得的DNA检测量较高；在塑料绳索中，4种前处理方法获得的DNA检测量均值无明显差异，但以使用直接剪取法进行前处理获得的DNA检测量较高从总体来看，使用胶带粘取法和真空吸附法进行前处理时，其适用检材的类型较多；以直接剪取法进行前处理获得的DNA量普遍较高；使用胶带粘法进行前处理获得的DNA检测量数值普遍较均衡，且DNA量较高，离群值较少。详见表3、图3和图4。2.2分型结果所有样品经过电泳获得分型结果，DNA检测率为69.3%，渗透性载体的检测率为78.1%。其中，棉线手套的检测率为83.3%，布片的检测率为83.3%，粗棉质绳索的检测率为87.5%，细棉质绳索的检测率为58.3%；非渗透性载体的检测率为58.8%，其中，模拟门把手的检测率为70.8%，玻璃片的检测率为45.8%，塑料绳索的检测率为45.8%。渗透性载体的检测率明显高于非渗透性载体的检测率。所有检材中29%的样品DNA获得了完整分型图谱。不同载体的DNA检验效果不同，其中以渗透性检材的DNA分型结果的平均等位基因数较高，非渗透性检材的DNA分型结果的平均等位基因数较低，但由于同是微量接触类检材，其DNA量均较低，多数DNA无完整分型结果，7种载体的DNA检测到的平均等位基因数无较明显差异，详见表4。实验选取的8个个体产生的分型结果各不相同，其平均等位基因数虽然不同，但在男女个体之间并无明显差异，且分型结果与定量结果基本一致，定量结果较高的DNA分型结果较好，平均等位基因数较多，由于个体间分型等位基因数不同，所以平均等位基因数结果与定量结果稍微不同，但总体相一致，详见图5。由于检材DNA量较低，分型结果等位基因数均较少，但4种前处理方法处理不同载体后的DNA检验效果并不相同，例如布片，使用直接剪取法与胶带粘取法进行前处理获得的DNA平均等位基因数明显高于使用真空吸附法进行前处理获得的DNA平均等位基因数，详见图6。2.3放置不同时间段的实验结果棉线手套和模拟门把手放置不同时间段后，使用真空吸附法进行前处理，然后进行DNA提取、定量和扩增。其定量结果显示，DNA检测量在360d内，并未随着时间推移而降低，其DNA量未发生明显改变。棉线手套为渗透性载体，其DNA检测量在5个不同个体之间随着时间推移无明显变化；模拟门把手为非渗透性载体，其DNA检测量在5个不同个体之间随着时间推移无明显降低趋势，详见图7和图8。统计STR分型结果，其平均等位基因数在不同时间段无明显减少趋势，其分型图无明显差异，由于检材制备时搓拉时间相对较长，DNA检测量较多，均获得完整DNA分型图谱，见图9和图10。3讨论本实验针对7种常见的微量接触类检材载体和4种常规前处理方法，对微量接触类检材进行了系统研究和探索。从不同载体上DNA的检测量有何不同、不同前处理方法对DNA检测量和检验效果有何影响，以及此类检材在常温封闭状态下的最佳检验时效等方面进行了一系列研究。为了更便于本实验的详细研究，每份检材的制备时间约为10s，比国际报道中的检材制备时间（2～3s）略长，所以实验中DNA的量高于国际同行的相关报道。在实际案件中，犯罪分子与受害人之间发生争执时，多为扯拉或拖拽等用力方式，所以本实验为真实模拟案件检材性质，采用了“用力搓拉”而非国际通用的“用力紧握”的处理方法。实验中，渗透性载体的DNA检测量和检验效果高于非渗透性载体的DNA检测量和检验效果，且其差异有统计学意义。实验总体上，渗透性载体的DNA检测率高于非渗透性载体的检测率。实验设计中，针对不同载体，8个无关个体进行同样的检材制备，从图1和表1中可以看出，不同载体的DNA检测量明显不同，从样本均数看，DNA检测量为：棉线手套>布片>粗棉质绳索>模拟门把手>细棉质绳索>塑料绳索>玻璃片。从表2可以看出，这种在不同载体之间的DNA量的不同有明显统计学差异。检材制备时间相同，人员均为8个无关个体，可以得出，不同载体在同样条件下的皮肤接触，其DNA检测量存在差异，即不同载体残留DNA的能力有差异。渗透性载体较易吸附和残留DNA，非渗透性载体不易残留DNA。实验选取了同样质地的粗细不同的两种绳索，在同样的实验个体和同样的前处理方法下，粗细两种绳索的DNA检测量和检验效果并不相同。二者获得的DNA检测量在统计学上无明显差异，但粗棉质绳索的均值为5.41ng，细棉质绳索的均值为3.71ng，从检验效果来看，粗棉质绳索的检验效果高于细棉质绳索的检验效果。这可能是由于粗棉质绳索与手部的接触面积相对较大，更能在其表面残留DNA。实验针对8名无关个体进行检材制备时，其中6名为男性个体，两名为女性个体，在这8个个体中，其DNA检测量和检验效果有差异，其差异主要表现在实验个体5和其他个体之间较明显。8个个体年龄均在20-30岁之间，身高体重指数按亚洲地区标准均在正常范围内，身体体检状态均为健康，8个个体体征和健康状态方面均无明显差异，均无皮肤疾病，实验中多次对个体5进行重复检材制备和DNA检测，实验观察到其DNA检测量始终较高，此种现象尚待进一步研究。针对同一种载体，4种前处理方法所获得的DNA检测量从统计学角度无明显差异，但其均值和标准差却直观表明其差异，由于微量接触类检材的DNA检测量普遍较低，从统计学角度比较数值，其差异性并不明显，但从DNA检测量的均值来看，不同的前处理方法用于不同检材时，其DNA检测量和检验效果不同。图4更直观地表明了4种前处理方法获得的DNA检测量的均值的不同，实验中共有7种载体，其中4种载体为渗透性载体，3种为非渗透性载体。使用直接剪取法进行前处理获得的DNA检测量较高，使用直接剪取法进行前处理的5种载体中，4种为渗透性载体；使用真空吸附法和胶带粘取法进行前处理的为全部7种载体；使用两步擦拭法进行前处理的3种载体均为非渗透性载体。渗透性载体的DNA检测量普遍高于非渗透性载体，同样，使用直接剪取法进行前处理的基本都是渗透性载体，使用真空吸附法和胶带粘取法进行前处理的为全部载体，而使用两步擦拭法进行前处理均为非渗透性载体，其DNA检测量均值则如图4所示。由此可见，4种前处理方法在处理不同载体时，胶带粘取法和真空吸附法普遍适用于各种类型的载体，且DNA检测量在针对不同类型的载体时也较均衡。但在针对渗透性载体时，其二者获得的DNA检测量和检验效果低于使用直接剪取法进行前处理获得的DNA检测量和检验效果。在针对非渗透性载体时，其二者获得的DNA检测量和检验效果高于使用两步擦拭法进行前处理获得的DNA检测量和检验效果。微量接触类检材常温干燥和封闭状态下放置不同时间后，其DNA检测量和检验效果随着时间推移（在360d内）无明显变化，无明显降解趋势。实验选择了渗透性载体和非渗透性载体的两种载体作为代表进行实验，其DNA检测量和检验效果在两种载体之间无明显差异和变化。实验结果说明干燥的微量接触类载体在常温干燥的环境下放置，其DNA在360d内无明显降解。放置不同时间段的检材，其检材制备时搓拉时间较长，DNA检测量和检验效果较好，说明微量接触类检材DNA的残留与载体和皮肤的接触时间长短有明显关系，其DNA检测量与皮肤和载体接触时间的具体关系尚待进一步研究。总之，本研究通过针对微量接触类检材进行一系列研究，从不同载体上DNA的检出量和检验效果的不同，不同前处理方法对微量接触类检材的DNA检出量和检验效果的影响，以及微量接触类检材的最佳检验时效等角度出发对此类检材进行了系统探讨。首先本实验明确了不同载体的DNA检出量和检验效果不同，渗透性载体的DNA检测量高于非渗透性载体的DNA检测量，不同的前处理方法在针对不同类型的载体时存在差异，微量接触类检材在常规条件下放置时，360d内间其DNA检测量和检验效果无明显变化。近年来，微量接触类检材占据了案件中检材的主要部分，本实验的研究结果将有助于指导针对微量接触类检材的检验方法和处理办法，为此类检材的快速检验提供新的途径，为存放不同时间后的检材的检验的必要性提供了数据证明，为公安机构和科[11]研院所针对此类检材的检验提供了可靠的数据支持和理论依据，提高了微量接触类检材的物证证明力，为案件侦破和科学研究提供了有力支持。参考文献（References）：[1]WIEGAND 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