PPARγ激动剂通过上调解偶联蛋白2抑制高糖介导的内皮细胞活性氧生成*

王沛坚， 王秋林， 杨 震， 王 芳， 蒲春华， 李文章， 梁登攀， 周 鹏

(成都医学院第一附属医院心内科,四川 成都 610500)



PPARγ激动剂通过上调解偶联蛋白2抑制高糖介导的内皮细胞活性氧生成*

王沛坚， 王秋林， 杨 震， 王 芳， 蒲春华， 李文章， 梁登攀， 周 鹏△

(成都医学院第一附属医院心内科,四川 成都 610500)

目的： 探讨过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)对高糖介导的血管内皮细胞活性氧(ROS)生成的影响及机制。方法: 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以高糖(33 mmol/L D-葡萄糖)培养基培养，并以低糖培养基(5.5 mmol/L D-葡萄糖)作为对照。分别利用超氧阴离子和一氧化氮(NO)的荧光探针观察PPARγ激动剂比格列酮对高糖环境下内皮细胞超氧阴离子和NO水平的影响，以Western blotting法观察解偶联蛋白2(UCP2)的表达。结果: PPARγ激动剂比格列酮可显著抑制高糖介导的ROS生成，并可防止高糖介导的内皮细胞NO水平的下降，而上述作用可被PPARγ的阻断剂GW9662所阻断。PPARγ激动剂可上调内皮细胞UCP2的表达，而通过genipin抑制UCP2可显著减弱PPARγ激动剂的作用。结论: 激活PPARγ可显著抑制高糖介导的ROS的生成，而该作用可能与其上调UCP2的表达有关。

过氧化物酶增殖物受体γ； 解偶联蛋白2； 氧化应激； 内皮细胞

糖尿病是心血管疾病的重要危险因素，相关的心脑血管并发症如脑卒中、冠心病、慢性心力衰竭等是严重危害人类健康的重大疾病[1]。最新的调查研究表明，我国目前已有1.14亿的糖尿病患者，而成人中更有50%的糖尿病前期患者[2]。因此，对于糖尿病及其相关心血管并发症的防治是我国面临的一个重大公共卫生问题。内皮损伤是众多心血管疾病的起始环节。高糖环境下通过多种途径如糖基化终末产物、多元醇代谢途径、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活、线粒体功能障碍等导致血管内皮细胞的损害[3-4]。目前的共识认为，氧化应激是上述的途径造成血管内皮损害的共同环节[5-6]。但外源性补充抗氧化剂如维生素C和维生素E等对心血管疾病的远期疗效研究结果仍存在一定的争议[7-8]。研究表明，过氧化物酶体增殖物受体(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)不但具有显著的代谢保护作用，还由于其特有的抗氧化应激作用对衰老相关的心脑血管功能障碍具有良好的改善作用[9]。但PPARγ对高糖介导的血管内皮氧化应激的影响及其相关的机制尚无相关的报道。在本研究中，我们拟利用高糖复制内皮细胞损伤模型，观察PPARγ对高糖介导的内皮细胞ROS产生的影响及对其机制进行初步的探索。

材 料 和 方 法

1 细胞和实验材料

人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells， HUVECs) 购于江苏省齐氏生物科技有限公司。

二氧化碳培养箱(SHELDON)；去离子水过滤器(Millipore)； pH 计和核酸蛋白分析仪(Beckman)；匀浆机(IKA)；电泳仪(Bio-Rad)；凝胶扫描成像系统(Bio-Rad)； TE2000-U倒置荧光显微镜(Nikon)。

二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)、4,5-二氨基乙酰乙酸荧光素(4,5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2DA; Sigma)；抗GAPDH抗体和抗UCP2抗体(Santa Cruz)；胎牛血清(Hyclone)，抗生素和DMEM 培养基(Gibco)。

2 方法

2.1 细胞的分组及培养 HUVECs用低糖DMEM培养基 (含10%胎牛血清和1%抗生素)于37 ℃、5% CO2条件下培养。分组处理如下：(1)对照(control)组 (干预时给予同体积的DMSO)；(2) 高糖(high glucose, HG)组(含33 mmol/L的D-葡萄糖DMEM培养基培养)； (3)HG+比格列酮(pioglitazone, PIO)组(高糖培养基培养的细胞中加入比格列酮，10 μmol/L)；(4)HG+PIO+GW9662组(高糖培养基培养的细胞中加入比格列酮10 μmol/L，GW9662 5 μmol/L)；(5)HG+PIO+京尼平(genipin，10 μmol/L)组干预时间为24 h。细胞种于6孔板中，每组至少重复3次。

2.2 DHE染色[10]取适量DHE染料溶于DMSO中配制成0.01 mol/L的储备液，4 ℃避光储存。在干预后的血管内皮细胞中加入终浓度为40 mmol/L的染色液，37 ℃避光孵育30 min。用新鲜Krebs溶液洗涤3次后荧光显微镜下进行观察。Krebs 溶液(mmol/L)：NaCl 119,NaHCO325,glucose 11.1,KCl 4.7,KH2PO41.2,MgSO41.2,CaCl22.5,pH 7.4。

2.3 内皮细胞NO水平的测定[10]在干预后的血管内皮细胞中加入终浓度为5 mmol/L的DAF-2DA，37 ℃避光孵育45 min。用Krebs溶液洗涤3次后置于荧光显微镜下，用FITC滤光片进行照相。

2.4 Western blotting[10]取100 mg 细胞加入裂解液裂解细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度。蛋白上样量50 μg，经SDS-PAGE 转移至PVDF 膜上，封闭后加入 I抗和Ⅱ 抗，化学发光试剂增强反应，X 线片压片曝光，凝胶成像系统分析结果。

3 统计学处理

以SPSS 13.0 统计分析软件进行数据录入及统计分析，数据以均数±标准差 (mean±SD) 表示，采用非配对t检验进行组间比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义，Prism 3.0 软件制图。

结 果

1 PPARγ激动剂抑制高糖介导的HUVECs活性氧生成

与低糖对照组比较，高糖环境可显著增加内皮细胞ROS的生成 (P<0.01)；PPARγ激动剂比格列酮(10 μmol/L)可显著抑制高糖环境下活性氧的生成 (P<0.01)；而该作用可显著被PPARγ阻断剂GW9662(5 μmol/L)或genipin(10 μmol/L)所阻断，(P<0.01)，见图1。

2 PPARγ激动剂显著防止高糖环境介导内皮细胞NO水平的下降

与低糖对照组比较，高糖环境下内皮细胞的NO水平显著下降(P<0.01)；PPARγ激动剂比格列酮可显著防止高糖环境下NO水平的下降(P<0.01)；但该作用同样可被PPARγ阻断剂GW9662(5 μmol/L)或genipin(10 μmol/L)所阻断，见图2。

3 PPAR γ激动剂可显著上调UCP2的表达

近年研究发现，PPARγ可调控线粒体蛋白UCP2，而UCP2是近年被发现与氧化应激密切相关的线粒体膜蛋白[11-12]。因此，我们利用Western blotting法分析了PPARγ的激动剂对UCP2的调控作用。结果发现，PPARγ可显著上调高糖环境下血管内皮细胞UCP2的蛋白表达 (P<0.01)；而该作用同样可被PPARγ的阻断剂所阻断(P<0.01)，见图3。

Figure 1.The effect of PPARγ agonist on high glucose-induced ROS level elevation in HUVECs.Mean±SD. n=6. ## P<0.01 vs control group; **P<0.01 vs HG group; △△ P<0.01 vs HG+PIO group.

讨 论

高糖环境导致氧化应激水平的升高是糖尿病致血管损害的关键环节[5]。内皮作为血管组织的第一屏障最先遭受ROS的攻击。近年发现，PPARs(包括PPAR、PPARβ/δ和PPARγ)不但具有显著的代谢改善作用，还具有良好的血管保护作用[13]。已知临床常用的PPARγ激动剂吡格列酮具有显著的降糖效应，但其是否有独立于降糖以外的保护糖尿病状态下血管内皮的效应，目前并无相关的研究报道。在本研究中我们首先观察了吡格列酮对高糖介导的血管内皮细胞活性氧产生的影响。结果发现PPARγ激动剂吡格列酮可显著抑制高糖介导的血管内皮细胞氧化应激水平的升高并可被PPARγ的拮抗剂阻断。氧化应激水平的升高可导致具有内皮保护作用的NO水平下降，从而进一步导致血管内皮结构和功能的损害[14]。我们利用NO的荧光探针进一步分析了吡格列酮对高糖环境下血管内皮细胞NO水平的影响。与既往的研究一致，高糖环境可显著减少内皮细胞NO的水平，而吡格列酮可显著防止高糖介导的NO水平的下降。上述结果提示吡格列酮具有显著的保护高糖介导的血管内皮损害的作用，而该作用是通过激活PPARγ实现的。

但PPARγ对高糖环境介导的血管内皮损伤的保护作用机制是什么？既往研究证实，PPARγ可显著上调线粒体蛋白UCP2mRNA转录水平，而该作用可能依赖于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化[11, 15]。UCP2作为线粒体内膜上的蛋白，其介导的质子漏可降低线粒体膜电位从而防止线粒体活性氧的生成[16]。近年研究发现，UCP2是机体内源性抗氧化应激的一个重要分子，机体氧化应激水平的升高可致其激活，从而使转录水平升高，表达增加，是机体应对氧化应激的一种反馈性调节机制。UCP2不但具有对抗衰老介导的活性氧产生的增加，延长寿命的作用，还具有防止高糖介导的血管内皮功能损害，通过过表达UCP2可显著防止高糖介导的血管内皮功能障碍[17-18]。为此，我们利用Western blotting的方法观察了PPARγ对UCP2表达的调节作用。结果发现，PPARγ激动剂可显著上调高糖环境下UCP2的表达水平。为进一步明确UCP2对PPARγ介导的血管内皮保护作用的影响，我们进一步利用UCP2抑制剂genipin观察其对PPARγ激动剂吡格列酮效应的影响。结果发现，genipin可显著抑制吡格列酮的作用，提示PPARγ拮抗高糖介导的血管内皮氧化应激损伤的作用依赖于UCP2。

综上所述，我们的研究结果证实了PPARγ激动剂吡格列酮可显著防止高糖介导的血管内皮细胞ROS水平的升高，而该作用可能是通过上调UCP2而实现的。虽然已知氧化应激是高糖介导的血管损害的关键机制，但维生素C和维生素E等外源性的抗氧化剂防治心血管疾病仍存在一定的争议。因此，PPARγ调控的内源性抗氧化应激靶点UCP2可为相关心血管疾病的防治提供新的干预思路。

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PPARγ agonist inhibits high glucose-induced production of reactive oxygen species by UCP2 up-regulation

WANG Pei-jian, WANG Qiu-lin, YANG Zhen, WANG Fang, PU Chun-hua, LI Wen-zhang, LIANG Deng-pan, ZHOU Peng

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China.E-mail:ap216g@163.com)

AIM: To explore the effects of PPARγ on the elevated level of reactive oxygen species (ROS) induced by high glucose and its mechanism. METHODS: Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured with DMEM containing high glucose (33 mmol/L D-glucose), and DMEM containing lower glucose (5.5 mmol/L D-glucose) was used as control. Superoxide anion and nitric oxide fluorescence probes were used to observe the effects of PPARγ agonist on ROS and NO productions in the HUVECs. The uncoupling protein 2 (UCP2) protein level in the HUVECs was detected by Western blotting. RESULTS: PPARγ agonist pioglitazone inhibited the ROS generation and prevented the decrease in NO level under high glucose condition, and these effects were reversed by pretreatment with PPARγ antagonist GW9662. The results of Western blotting indicated that PPARγ agonist pioglitazone up-regulated the UCP2 expression under high glucose condition, and this effect was also blocked by GW9662. Inhibition of UCP2 by genipin attenuated the effect of pioglotazone on the ROS production. CONCLUSION: Activation of PPARγ inhibits ROS generation under high glucose condition, and this effect may mediate by up-regulation of UCP2.

Peroxisome proliferator-activated receptor γ; Uncoupling protein 2; Oxidative stress; Endothelial cells

1000- 4718(2015)01- 0049- 05

2014- 05- 22

2014- 11- 11

四川省教育厅科研项目(No. 14ZB0234)；成都医学院科研项目(No. CYZ13-001)

△通讯作者 Tel: 028-83016644； E-mail: ap216g@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.010