亚硒酸钠对UVB损伤人角质形成细胞的保护作用

刘赛君， 郭梅艳， 邓列华， 赵 刚， 胡云峰

(1暨南大学附属第一医院皮肤科，广东 广州 510630； 2河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056002)



亚硒酸钠对UVB损伤人角质形成细胞的保护作用

刘赛君1▲， 郭梅艳2▲， 邓列华1△， 赵 刚1， 胡云峰1

(1暨南大学附属第一医院皮肤科，广东 广州 510630；2河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056002)

目的： 研究亚硒酸钠(Na2SeO3)对中波紫外线(UVB)损伤人角质形成细胞的保护作用。方法： 培养永生化人角质形成细胞(HaCaT细胞)，实验分为4组处理：(1)正常对照组；(2)Na2SeO3组：分别加入1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 μmol/L 的Na2SeO3预孵育24 h；(3)UVB组：300、600和900 J/m2UVB照射；(4)Na2SeO3+UVB组：Na2SeO3预孵育24 h后进行UVB照射。采用MTT法检测细胞增殖活性，采用流式细胞仪检测300 J/m2UVB照射后细胞的凋亡率。结果： (1)UVB组与正常对照组比较，细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，细胞活性与UVB照射剂量呈负相关；(2)Na2SeO3组与正常对照组比较，细胞增殖活性无明显差异；(3)不同浓度Na2SeO3+UVB组与UVB组比较，细胞增殖活性增加，差异显著(P<0.05)，其中100 nmol/L组促进细胞增殖作用最强；(4)300 J/m2UVB照射后，不同浓度Na2SeO3+UVB组与UVB组比较，凋亡率下降，差异显著(P<0.05)，其中100 nmol/L组抑制凋亡作用最强。结论： UVB对角质形成细胞有损伤作用，且与照射剂量呈正相关；Na2SeO3具有光保护性能，可减轻UVB辐射损伤人角质形成细胞。

紫外线； 角质形成细胞； 光保护； 亚硒酸钠

长期、过量的紫外线辐射可导致皮肤日晒伤、光老化甚至皮肤肿瘤[1-2]。中波紫外线(ultraviolet-B, UVB)是造成皮肤光损伤的主要原因[3]。角质形成细胞位于皮肤表皮层，是UVB作用的靶细胞。UVB引起皮肤光损伤的机制较复杂，最为重要的一点是通过氧化应激产生过多的活性氧簇[4]，破坏细胞膜、线粒体膜及使各种细胞酶类失活，并影响相关细胞信号转导和基因表达，导致细胞损伤、细胞凋亡或癌变，从而引起皮肤光老化，诱发皮肤癌等。

微量元素硒是机体重要的抗氧化酶——谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的必需组分，具有抗氧化、抗肿瘤[5]、保护心肌和肝细胞[6-7]、提高免疫功能的作用，与人体健康密切相关。研究表明硒与一些皮肤病如银屑病、白癜风、皮肤肿瘤等的发生发展密切相关[8]，亚硒酸钠(sodium selenite，Na2SeO3)是一种常用的人体补硒制剂。本论文拟研究不同剂量Na2SeO3处理对UVB照射损伤永生化人角质形成细胞(HaCaT细胞)的保护作用。

材 料 和 方 法

1 细胞、主要试剂和仪器

永生化人角质形成细胞株(HaCaT细胞)购自中国典型培养物武汉大学保藏中心。

胰蛋白酶和四甲基偶氮唑蓝(MTT)粉(Sigma)；MEM培养基(Gibco)；胎牛血清(天津市灏洋生物制品公司)；Na2SeO3(广州化学试剂厂)；UVB灯管(北京电光源研究所)；紫外线辐照计(北京师范大学光电仪器厂)；CO2培养箱(NAPCO)；可见光分光光度计(PERKIN ELMER)；流式细胞仪(Coulter)；倒置相差显微镜(Olympus)。

2 方法

2.1 细胞培养 HaCaT细胞在37 ℃、5% CO2条件的细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的MEM培养基培养。将处于亚融和状态的细胞用0.25%胰酶和0.03% EDTA消化传代，1×108/L细胞密度接种于培养板中。

2.2 分组处理 HaCaT细胞处理分为4组：(1)正常对照组；(2)Na2SeO3组：加入1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 μmol/L的Na2SeO3预孵育24 h；(3)UVB组：细胞用300、600和900 J/m2的UVB照射；(4)Na2SeO3+UVB组：Na2SeO3预孵育24 h后行UVB照射；每组设3个复孔，重复实验3次。

2.3 UVB 照射 2根平行UVB灯管，波长为308 nm，功率为8 W，光源距培养板垂直距离为6 cm，用UVB紫外线辐照计标定辐照强度为2 W/m2。UVB剂量=UVB辐照强度(W/m2)×时间(s)，剂量300、600和900 J/m2。照射前吸去细胞培养液，用PBS冲洗1次，再加入少量PBS覆盖底面。UVB照射后，弃去覆盖液PBS，加入培养基继续培养24 h。

2.4 光损伤的细胞形态学观察 用倒置相差显微镜观察细胞损伤的形态变化并摄像。

2.5 MTT法检测细胞增殖活性 向每100 μL培养基中加入20 μL浓度为5 g/L的MTT，37 ℃继续孵育4 h，弃去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解，室温下振荡15 min，使蓝紫色结晶物充分溶解，选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 经300 J/m2UVB照射后，分别检测正常对照组、UVB组和Na2SeO3+UVB组细胞的凋亡率。将各组细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，离心收集细胞，以体积分数80%乙醇固定。PBS清洗细胞3次。取出4 ℃保存的含50 mg/L Triton的碘化丙啶，于各试验管中分别加入200 μL碘化丙啶，振荡成单细胞悬液，避光室温静置30 min。300目滤网过滤后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。应用SPSS 10.0统计软件对实验数据进行t检验或单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 UVB照射损伤HaCaT的形态学观察

正常对照组的HaCaT细胞呈典型上皮样特征，高核浆比例，细胞排列紧密，轮廓清楚折光好。UVB组细胞受到不同程度损伤，表现为细胞逐渐变圆、皱缩，悬浮细胞增多，细胞肿胀、细胞碎片增多，细胞损伤程度与UVB照射剂量呈正相关，见图1。

Figure 1.The effect of different doses of UVB irradiation on morphology of HaCaT cells (×100).

2 UVB照射对HaCaT细胞增殖的影响

经MTT检测发现UVB组A值低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明不同剂量UVB照射后24 h，HaCaT细胞增殖活性下降，细胞活性与UVB照射剂量呈负相关。

Na2SeO3组细胞活性与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)，说明所加药物在实验浓度对细胞无毒性作用。

浓度为1 nmol/L的Na2SeO3+UVB组细胞活性与UVB组比较无显著差异(P>0.05)；其它浓度的Na2SeO3+UVB组的细胞活性与UVB组比较细胞活性显著升高(P<0.05)，其中100 nmol/L组细胞活性最高,见表1。

表1 UVB照射和Na2SeO3处理后MTT实验的吸光度值

#P<0.05vsnormal control group (0 J/m2UVB);*P<0.05vsUVB group (0 nmol/L Na2SeO3).

3 Na2SeO3对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率的影响

经流式细胞术检测，在用碘化丙啶荧光染料分析图上，经300 J/m2UVB照射后，HaCaT细胞中的凋亡细胞在G1/G0期前出现亚二倍体峰，UVB组凋亡率与正常对照组相比较，差异显著(P<0.05)，表明UVB辐射诱导HaCaT细胞发生凋亡。

经300 J/m2UVB照射后，1 nmol/L Na2SeO3+UVB组的细胞凋亡率与UVB组比较无显著差异(P>0.05)；其它浓度的Na2SeO3+UVB组细胞凋亡率较UVB组明显下降(P<0.05)，其中100 nmol/L组凋亡率最低。这说明Na2SeO3对UVB照射致HaCaT细胞损伤具有光保护作用，抑制其凋亡,见图2。

Figure 2.The effects of Na2SeO3 on the apoptotic rate of HaCaT cells induced by 300 J/m2 UVB. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs UVB group.

讨 论

日光中的紫外线对皮肤晒伤、皮肤炎症、皮肤老化与皮肤癌的发生与发展有重要影响[1-3]。自然界能穿过臭氧层引起人皮肤损伤的紫外线成分是UVB(280～315 nm)和UVA(315～400 nm)，UVB对皮肤的损伤强度比UVA大800～1 000倍，且UVB有更强的诱变性和致癌性，是造成皮肤光损伤的主要原因[2-3]。一般认为，UVB照射损伤皮肤细胞，其具体机制较为复杂。王会营等[9]认为HaCaT细胞经紫外线照射后，线粒体去极化作用增强、质量降低，这些变化与细胞凋亡相关。此外，紫外线能诱导皮肤产生过多的活性氧簇，引起细胞凋亡造成皮肤损伤[4]。我们的研究发现，300、600和900 J/m2UVB照射均导致HaCaT细胞增殖活性下降，且其程度与UVB照射剂量呈正相关。同时，结果也表明300 J/m2UVB辐射即可诱导HaCaT细胞凋亡。一般认为，UVB到达地球表面时辐射强度约为180～300 J/m2[10]，这说明正常日晒条件下的UVB剂量即可损伤皮肤。研究表明，局部外用抗氧化剂如维生素C和E、茶多酚等可以减缓紫外线损伤皮肤[11]。

硒是人体必需的微量元素，适量的硒化合物可保护细胞和细胞膜的结构功能不受氧化作用的损伤。而关于硒缓解紫外线损伤皮肤的研究也有不少报道，如Burke等[12]发现局部外用硒蛋氨酸可以减轻UV辐射引起的炎症和色素沉着，并可降低UV诱发的皮肤肿瘤的数量。Rafferty等[13]则发现10 nmol/L～1 μmol/L 的Na2SeO3具有光保护作用，能抑制宽谱紫外线(包括UVB、UVA和少量UVC)辐射引起的原代培养人角质形成细胞凋亡。而我们的研究也发现，10 nmol/L～1 μmol/L Na2SeO3能抑制UVB照射引起的HaCaT细胞凋亡，增加细胞增殖活性，说明亚硒酸钠对HaCaT细胞具有很好的保护作用。从本论文研究结果来看，100 nmol/L为其最佳保护浓度。但硒对UVB辐射的光防护作用机制目前仍未完全清楚，尚待进一步研究阐明。一般认为，硒化合物在体内主要是通过硒蛋白介导其保护作用。人类皮肤细胞表达至少15种硒蛋白，包括谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶家族，均有抗氧化活性，能减缓紫外线对皮肤造成的氧化损伤。UVB诱导的细胞凋亡由Fas或P53通路介导，氧化应激参与P53的激活[13]。有研究认为硒化合物具有抗氧化作用，能抑制UVB诱导的皮肤细胞P53激活和蛋白聚集[14]，从而阻止细胞凋亡。此外Na2SeO3能抑制UVB诱导的caspase-3活化，而caspase-3是UV辐射通过能量沉积损伤细胞的关键酶[15]。

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Protective effect of sodium selenite on human keratinocytes from ultraviolet-B irradiation

LIU Sai-jun1, GUO Mei-yan2, DENG Lie-hua1, ZHAO Gang1, HU Yun-feng1

(1DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China;2AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan056002,China.E-mail:liehuadeng@126.com)

AIM: To investigate the protective effect of sodium selenite (Na2SeO3) on human keratinocytes under ultraviolet-B (UVB) irradiation. METHODS: The cultured HaCaT cells were divided into 4 groups: (1) normal control group; (2) Na2SeO3group: pretreated with Na2SeO3at doses of 10 nmol/L, 50 nmol/L, 100 nmol/L, 200 nmol/L and 1 μmol/L for 24 h; (3) UVB group: irradiated with UVB at doses of 300, 600 and 900 J/m2; (4) Na2SeO3+ UVB group: after pretreated with Na2SeO3for 24 h, irradiated with UVB at doses of 300, 600 and 900 J/m2. The cell proliferation was detected by MTT assay. The apoptotic rates of HaCaT cells treated with UVB at dose of 300 J/m2were assessed by flow cytometry. RESULTS: Compared with normal control group, the cell proliferation activity in UVB group decreased significantly (P<0.05). The cell activity was inversely correlated with the irradiation intensity. No significant difference of the cell activity between Na2SeO3group and normal control group was observed. The cell proliferation in Na2SeO3+UVB group was higher than that in UVB group significantly (P<0.05). Na2SeO3at concentration of 100 nmol/L showed the strongest activity to promote cell proliferation. After 300 J/m2UVB irradiation, the apoptotic rate in Na2SeO3+UVB group decreased significantly (P<0.05) compared with UVB group. The inhibitory effect of Na2SeO3at concentration of 100 nmol/L on apoptosis was the strongest.CONCLUSION: The damage of human keratinocytes by UVB irradiation is in a dose-dependent manner. The photoprotection performance of Na2SeO3reduces the damage of human keratinocytes induced by UVB irradiation.

Ultraviolet rays; Keratinocytes; Photoprotection; Sodium selenite

1000- 4718(2015)01- 0177- 04

2014- 08- 25

2014- 11- 10

△通讯作者 Tel： 020-38688115; E-mail: liehuadeng@126.com

▲并列第1作者

R758.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.033