1,2-二甲磺酸乙烷预处理对雄性SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响*

卜晨峰， 庾淦深， 徐 银， 苏志坚， 黄亚东， 苏泽轩△

(暨南大学 1附属第一医院泌尿外科， 2医药生物技术研究开发中心，广东 广州 510632)



1,2-二甲磺酸乙烷预处理对雄性SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响*

卜晨峰1， 庾淦深1， 徐 银1， 苏志坚2， 黄亚东2， 苏泽轩1△

(暨南大学1附属第一医院泌尿外科，2医药生物技术研究开发中心，广东 广州 510632)

目的： 探究1,2-二甲磺酸乙烷(EDS)预处理是否对雄性SD大鼠缺血再灌注肾脏损伤有保护作用及其可能机制。方法: 夹闭双侧肾蒂45 min，构建雄性SD大鼠肾脏缺血再灌注模型；48只雄性SD大鼠随机分为6组：空白对照组(blank)、假手术组(sham)、肾脏缺血再灌注组(I/R)、EDS预处理+肾缺血再灌注组(EDS+I/R)、EDS预处理+睾酮+肾缺血再灌注组(EDS+TST+I/R)和阉割+肾缺血再灌注组(Cast+I/R)。术前1 h及再灌注后24 h采血检测血清黄体生成素、睾酮、血肌酐、血尿素氮以及尿液肾损伤分子1(KIM-1)水平；取肾脏组织，检测TNF-α水平、Fas mRNA与caspase-3蛋白表达情况。结果: (1) EDS+I/R与Cast+I/R组比较，血肌酐和尿素氮无显著差异(P>0.05)，但KIM-1水平却低于Cast+I/R组(P<0.05)，2组血肌酐、血尿素氮和KIM-1均高于另外3组(P<0.05)。(2) 与术前1 h相比，再灌注术后24 h，EDS+I/R、Cast+I/R及EDS+TST+I/R组均伴睾酮及黄体生成素下降(P<0.05)。(3) EDS+I/R组TNF-α水平、Fas mRNA及caspase-3蛋白表达水平均显著低于Cast+I/R与I/R组(P<0.05)。结论: EDS预处理可大幅降低血清睾酮水平，从而减轻雄性SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤，其机制可能与TNF-α介导的Fas/FasL通路有关。

1,2-二甲磺酸乙烷； 肾脏； 肾损伤分子1； 睾酮

肾缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)过程在肾移植等需要短时间内阻断肾血流的手术中广泛存在[1]。有临床研究发现，在急性肾衰竭患者中，男性的平均血肌酐(serum creatinine，SCr)日增长量、平均住院时间、随访等数据均明显劣于女性患者[2]。而手术阉割(castration，Cast)后的雄性大鼠，经过肾I/R处理后，肾损伤的程度接近雌性，且显著小于未阉割雄性组[3]。这提示睾酮(testosterone，TST)可能是影响男性肾脏损伤程度的激素之一。1,2-二甲磺酸乙烷(ethane 1,2-dimethanesulfonate, EDS)可以特异性引起睾丸间质细胞发生一过性凋亡，进而引起睾酮水平大幅下降[4]。但EDS预处理对雄性肾脏缺血再灌注的影响，国内外鲜有报道。本研究通过EDS预处理雄性SD大鼠，并建立肾脏缺血再灌注模型，以探讨EDS预处理对肾脏损伤程度的影响及其可能的机制。

材 料 和 方 法

1 动物和材料

SPF级雄性SD大鼠，9～10周龄，300～350 g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2008-0002。

EDS由暨南大学生命科学院惠赠；丙酸睾酮注射液购自上海通用药业股份有限公司；血清黄体生成素(luteinizing hormone, LH)和TST放射免疫检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所；肾损伤分子1(kidney injury molecule-1, KIM-1)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA试剂盒购自武汉华美生物有限公司； RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自威佳科技有限公司；caspase-3 I 抗购自Bioworld;SCr和血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)由美国Dimendion Rxl.全自动生化分析仪测定。

2 主要方法

2.1 分组与动物模型的构建 48只雄性SD大鼠随机分为6组(n=8)：空白对照(blank)组、假手术(sham)组、 I/R组、Cast+I/R组、EDS预处理+肾缺血再灌注(EDS+I/R)组、EDS预处理+睾酮+肾缺血再灌注(EDS+TST+I/R)组。EDS预处理为术前5 d 腹腔注射 EDS 75 mg/kg；阉割组缺血再灌注处理前15 d 摘除双侧睾丸；EDS+TST+I/R组在EDS处理后于皮下注射丙酸睾酮500 μg/kg 体重，其余各组注射等体积芝麻油，每天1次，直至缺血再灌注手术当天。考虑到睾酮有昼夜节律变化[5]，因此手术开始时间均为上午10时。空白对照组无需手术；其余各组术前禁食6～8 h，并剃净全腹，30 g/L戊巴比妥钠30～50 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒铺巾，腹正中切口，暴露双侧肾脏并游离肾蒂，假手术组仅游离双侧肾蒂，暴露45 min后缝合切口；其余组使用无损动脉夹夹闭双侧肾蒂，45 min后取下动脉夹，关腹。术中至苏醒前采用电热灯照射以维持体温。

2.2 标本采集 将大鼠置于代谢笼中收集术后24 h尿液标本。术前1 h及再灌注术后24 h，于密闭容器内用乙醚麻醉大鼠后，用直径1.0 mm毛细玻璃管刺破大鼠眼眶后静脉丛取2 mL 血液，取血后用灌胃针注入等体积生理盐水。再灌注术后24 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥钠 50 mg/ kg 麻醉, 开腹，取双肾组织，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 指标检测与方法

2.3.1 一般指标的检测 LH与TST采用放射免疫法测定；SCr与BUN采用全自动生化分析仪测定；TNF-α和KIM-1采用ELISA法测定，其中KIM-1检测的是尿液，TNF-α和则取肾皮质研磨上清液检测。所有指标的检测均严格遵循说明书要求操作。

2.3.2 Fas mRNA水平检测 采用RT-PCR法。取50 mg冻存肾组织，加入1 mL Trizol 后研磨成匀浆，抽取总RNA。取1 μg总RNA逆转录成cDNA，采用 PCR 基因扩增仪进行扩增。25 μL反应体系，反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循环反应30次；72 ℃ 10 min。2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。内参照为GAPDH。以Fas与内参照PCR产物的吸光度值之比来衡量Fas表达水平。引物序列见表1。

2.3.3 Caspase-3蛋白的检测 采用Western blotting法检测肾组织中caspase-3蛋白水平。取肾组织匀浆，提取蛋白，BCA法测量蛋白浓度。取 50 μg 样品，以 12% SDS-PAGE 分离蛋白，转至 PVDF膜上， 室温下 5% 脱脂奶粉封闭2 h，加入I 抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入II抗。37 ℃孵育1 h，化学发光法显色，曝光。利用 Quantity One 软件分析条带。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异(LSD)法。

结 果

1 建模结果分析

SD大鼠阉割后，伤口未出现感染，残留阴囊无积脓积液、斜疝等情况。肾缺血再灌注造模术中，阻断肾蒂后，肾脏变黑变暗，去除阻断夹后颜色转红。术后(处死前)未出现大鼠死亡。EDS及阉割组术后5 d血清中已检测不出睾酮。术后24 h摘除睾丸做HE染色，结果显示，EDS组睾丸间质组织可见少许残留疏松结缔组织，睾丸间质细胞难觅踪迹,见图 1。

Figure 1.Representative HE staining images of rat testicles 24 h after operation(×100). Black arrow shows the Leydig cells.

2 血清睾酮水平

术前1 h，blank、sham与I/R组睾酮水平间无显著差异(P>0.05);再灌注24 h后，sham组睾酮水平降至(1.11±0.18) μg/L，小于blank组(P<0.05)，但高于I/R组(P<0.05)。EDS+TST+I/R组术前1 h睾酮值为(0.89±0.26) μg/L，而再灌注后24 h降至(0.27±0.12) μg/L(P<0.05),见图2。

3 血清LH的水平

Blank、sham和I/R 3组间的LH水平术前1 h及再灌注后24 h无显著差异(P>0.05)，且都小于EDS+I/R、EDS+TST+I/R及Cast+I/R组(P<0.05)。EDS+I/R与Cast+I/R组间术前1 h、术后24 h 的LH水平均无显著差异(P>0.05)。再灌注后24 h，EDS+I/R、EDS+TST+I/R及Cast+I/R组的LH均低于相应术前1 h水平(P<0.05)；EDS+TST+I/R术前术后的LH值均低于EDS+I/R及Cast+I/R组(P<0.05)，见图3。

Figure 2.The changes of serum testosterone 1 h before and 24 h after the surgery. Mean±SD. n= 8. *P<0.05 vs 1 h before surgery； ▲P<0.05 vs sham group； △P<0.05 vs I/R group.# Acquired values of the serum testosterone are below the minimum detectable threshold.

Figure 3.The changes of serum luteinizing hormone 1 h before and 24 h after the surgery. Mean±SD. n= 8. *P<0.05 vs I/R group group； #P<0.05 vs EDS+I/R group .

4 血清肌酐、血尿素氮、尿KIM-1及肾组织TNF-α的水平

再灌注后24 h，blank和sham组在SCr、BUN、KIM-1及TNF-α指标上均无显著差异(P>0.05)；EDS+I/R及Cast+I/R组的SCr水平与blank和sham组相比较差异无统计学意义(P>0.05)；但前2组的BUN、KIM-1及TNF-α水平显著较高(P<0.05)；与Cast+I/R组比较，EDS+I/R组KIM-1与TNF-α水平较低(P<0.05)，而SCr和BUN在2组间差异无统计学意义。EDS+TST+I/R组的TNF-α平均值较Cast+I/R组高，但差异无统计学意义(P>0.05)。EDS+TST+I/R及I/R组的SCr、BUN与KIM-1水平均显著高于其余4组；2组之间3种指标差异无统计学意义，见图4。

5 肾组织Fas mRNA表达水平

再灌注后24 h，I/R组Fas mRNA表达水平最高，与其余各组的差异均有统计学意义(P<0.05)；EDS+I/R、Cast+I/R及EDS+TST+I/R 3组Fas mRNA表达水平依次升高，各组间差异显著(P<0.05)；Blank和sham组的Fas mRNA表达水平差异无统计学意义(P<0.05),见图5。

6 肾组织caspase-3蛋白的表达

再灌注后24 h，Cast+I/R与EDS+TST+I/R组间的caspase-3/β-actin 蛋白灰度比值无明显差异(P>0.05)。EDS+I/R组低于Cast+I/R组和EDS+TST+I/R组(P<0.05)。I/R组的caspase-3水平最高(P<0.05)。Blank和sham组间caspase-3表达水平差异无统计学意义(P<0.05),见图6。

讨 论

雄性动物体内睾酮超过95%是由睾丸间质细胞所分泌[6]，而睾酮水平对肾损伤的影响，目前还存在着争议。有研究发现阉割后的雄性大鼠，肾损伤程度小于未阉割组[7]；也有研究不支持此结论[8]。本实验中，事先给予EDS或手术阉割降低血睾酮水平的大鼠，其肾损伤程度显著小于对照组；而事先注射睾酮后，手术后肾脏损伤程度有所上升，这表明在肾I/R中，睾酮可能会对肾脏有着不利的影响。

EDS可以特异性地促进成熟睾丸间质细胞凋亡，因此睾酮水平大幅下降，以至在短时间内达到与手术阉割相同的效果[9]。EDS只对成熟睾丸间质细胞起作用，用药一段时间以后，睾丸间质祖细胞可重新分化为成熟睾丸间质细胞，睾酮的分泌也可得到恢复，这种特性使其可在需要暂时抑制睾丸分泌睾酮时使用[10]。KIM-1是近曲小管上皮细胞中的黏附因子，尿液中KIM-1变化的特异性和敏感性都较高，可作为早期诊断肾小管损伤的指标[11]。在本实验中，预先予以EDS的大鼠，与手术阉割组相比较，肾损伤程度在血肌酐和尿素氮指标上较为一致，而在尿液KIM-1指标上要优于手术阉割组。而2组在手术前、再灌注后，睾酮与黄体生成素水平均无显著差异，提示EDS优于手术阉割现象可能存在部分不依赖睾酮路径的机制。进一步实验发现，EDS组肾组织的TNF-α水平显著低于阉割组，Fas mRNA与caspase-3蛋白表达水平也较低，提示TNF-α介导的Fas/FasL通路可能参与该过程。

Figure 4.The effects of EDS/other processing on I/R-induced kidney injury. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs sham group； #P<0.05 vs I/R group; △P<0.05 vs EDS+I/R group.

Figure 5.The mRNA expression of Fas in the renal tissues detected by RT-PCR. Mean±SD.n=8. *P<0.05 vs sham group； #P<0.05 vs I/R group； △P<0.05 vs EDS+I/R group.

Figure 6.The protein expression of caspase-3 in the renal tissues detected by Western blotting. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs sham group； #P<0.05 vs I/R group; △P<0.05 vs EDS+I/R group.

有研究表明非特异性的创伤、手术等刺激也可导致一过性的睾酮水平下降[8]；本研究中此种现象得以再现。同时，在肾I/R过程睾酮水平的下降程度高于假手术组。此外，也有学者观察到雄性SD大鼠在肾I/R损伤后，其睾酮水平会出现一过性的下降[12]。本实验I/R组手术前后黄体生成素水平差异无统计学意义，但EDS处理或手术阉割组，其术前及再灌注后24 h，黄体生成素的水平也有不同程度的下降，提示睾酮水平的下降主要是黄体生成素所致。而在下丘脑-垂体-性腺轴中，黄体生成素可受到多种因素的调节，因此肾I/R损伤影响黄体生成素的过程尚需进一步探讨。

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Effects of ethane 1,2-dimethanesulfonate preconditioning on renal ischemia/reperfusion injury in male rats

BU Chen-feng1, YU Gan-shen1, XU Yin1, SU Zhi-jian2, HUANG Ya-dong2, SU Ze-xuan1

(1DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospital,2BiopharmaceuticalResearch&DevelopmentCenter,JinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:suz2008@163.com)

AIM: To investigate the effects of ethane 1,2-dimethanesulfonate (EDS) preconditioning on renal ischemia/reperfusion (I/R) injury in male Sprague-Dawley (SD) rats. METHODS: Male SD rats (n=48) were randomly assigned to 6 groups: blank, sham, I/R, EDS+I/R, EDS+ testosterone (TST) +I/R, and castration (Cast)+I/R. The renal pedicles were bilaterally occluded with a microvascular clamp for 45 min to establish renal I/R-induced injury model. Bilateral orchiectomy was conducted 2 weeks before surgery. EDS (75 mg/kg) was intraperitoneally injected 5 d before operation. Blood samples were collected 24 h after reperfusion from the vena orbitalis posterior plexus. Luteinizing hormone (LH), TST, serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), and kidney injury molecule-1 (KIM-1) were detected. The renal tissues were harvested to measure the level of TNF-α and the expression of Fas mRNA and caspase-3 protein. RESULTS: Serum TST levels in EDS+I/R group and Cast+I/R group were below the minimum detectable threshold. Compared with other groups, the rats in EDS+I/R group and Cast+I/R group had higher levels of SCr, BUN and KIM-1 (P<0.05). SCr and BUN levels showed no significant difference between EDS+I/R group and Cast+I/R group (P>0.05), but KIM-1 level in EDS+I/R group was lower than that in Cast+I/R group (P<0.05). After reperfusion for 24 h, the levels of TST and LH in EDS+I/R group, Cast+I/R group and EDS+TST+I/R group were lower than those 1 h before operation (P<0.05). Compared with Cast+I/R and I/R group, the TNF-α level and expression of Fas mRNA and caspase-3 protein were significantly decreased in EDS+I/R group (P<0.05). CONCLUSION: EDS preconditioning substantially reduces the serum TST level, thus attenuating I/R-induced acute renal injury. TNF-α-induced Fas/FasL pathway may be involved in this process.

Ethane 1,2-dimethanesulfonate; Kidney; Kidney injury molecule-1; Testosterone

1000- 4718(2015)01- 0054- 05

2014- 06- 04

2014- 11- 18

国家高技术研究发展计划(863计划)项目(No. 2007AA022006); 广州市科技信息局基金资助项目(No. 11A72070508)

△通讯作者 Tel: 020-38688074; E-mail: suz2008@163.com

R363.1+3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.011