罗格列酮对人腹膜微血管内皮细胞AQP1、VEGF-A及COX-2表达的影响*

陈争跃， 余雄伟， 聂振禹 ， 赵 宇， 步世忠， 包蓓艳△

(1宁波大学 糖尿病研究中心，润良糖尿病研究室，浙江 宁波 315211； 2宁波市泌尿肾病医院肾内科，浙江 宁波 315192)



罗格列酮对人腹膜微血管内皮细胞AQP1、VEGF-A及COX-2表达的影响*

陈争跃1， 余雄伟1， 聂振禹2， 赵 宇2， 步世忠1， 包蓓艳2△

(1宁波大学 糖尿病研究中心，润良糖尿病研究室，浙江 宁波 315211；2宁波市泌尿肾病医院肾内科，浙江 宁波 315192)

目的： 探讨罗格列酮对人腹膜微血管内皮细胞水孔蛋白1 (AQP1)、血管内皮生长因子A (VEGF-A) 及环氧合酶2 (COX-2)蛋白的影响。方法: (1) 体外培养人腹膜微血管内皮细胞并分为4组；用倒置显微镜观察细胞形态学变化；(2) Western blotting 检测细胞AQP1、VEGF-A和COX-2蛋白的表达；(3)real-time PCR检测细胞AQP1、VEGF-A及COX-2 mRNA 的表达。结果: 罗格列酮可促进人腹膜微血管内皮细胞增殖，上调AQP1蛋白及基因的表达(P<0.05)，下调VEGF-A和COX-2蛋白和mRNA的表达，过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPAR-γ)拮抗剂GW9662可部分抑制罗格列酮上调的AQP1表达(P<0.05)，但对VEGF-A及COX-2表达无明显影响(P>0.05)。结论: 罗格列酮能够上调腹膜微血管内皮细胞AQP1的表达，下调VEGF-A 及COX-2的表达，这可能与罗格列酮增加腹膜水转运、减轻腹膜纤维化有关。

腹膜微血管内皮细胞； 水孔蛋白1； 血管内皮生长因子； 环氧合酶2； 过氧化物酶体增殖物激活受体γ

腹膜透析是临床上治疗终末期肾衰竭的一种替代方法，而腹膜透析相关性腹膜纤维化是连续性非卧床腹透患者最严重的并发症，也是影响腹透病人长期生存和预后的重要因素。腹膜透析相关性腹膜纤维化的发生是一个复杂的病理发展过程，机制不完全明了，慢性腹膜炎症及高糖透析液对腹膜的损伤是目前已知的导致腹膜纤维化的2个重要原因，主要表现为腹膜对小分子溶质转运增加，超滤减少，而腹膜恰恰主要通过小孔和水孔蛋白1(aquaporin-1，AQP1)达到清除水的目的。过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ)是近年来备受关注的核内受体转录因子超家族成员之一，目前，PPAR-γ在抗器官纤维化方面的作用已成为新的研究热点[1]，而胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药罗格列酮 (rosiglitazone，RSG)是PPAR-γ的特异性激活剂，其能抑制转化生长因子β (transforming growth factor-β，TGF-β)、胶原蛋白和纤连蛋白的表达，该抑制作用能被PPAR-γ拮抗剂GW9662所抵抗。我们在前期的动物实验研究中发现，RGZ可以上调尿毒症腹膜透析大鼠腹透的超滤量，而这种上调作用可以部分被PPAR-γ拮抗剂GW9662所拮抗[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，研究发现，RGZ可通过抑制肾脏VEGF表达，延缓糖尿病肾病的发生，然而RGZ对人腹膜微血管内皮细胞表达VEGF的影响未见报道。环氧合酶(cyclooxygenase，COX)又称前列腺素过氧化物合成酶，目前对COX-2的研究多集中于肿瘤，几乎未见COX-2与腹膜血管组织的相关报道，COX-2能够通过诱导以VEGF为代表的促血管生长因子的表达，抑制血管内皮细胞的凋亡，促进肿瘤血管的增殖。为了探讨上述因子在腹膜血管内皮细胞中的表达及RGZ对其表达的影响，进一步研究腹膜纤维化的发生机制，我们就罗格列酮对人腹膜微血管内皮细胞AQP1、VEGF-A和COX-2表达的影响展开研究。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

改良型RPMI-1640培养基(Hyclone)；无酚红RPMI-1640培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco)； CCK-8检测试剂盒(日本同仁化学研究所)；罗格列酮和GW9662原粉(Cayman)；兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体、兔抗人血小板内皮细胞黏附分子(CD31)抗体、兔抗人结蛋白(desmin)抗体和兔抗人细胞角蛋白8抗体(北京博奥森公司)；HRP标记的驴抗兔Ⅱ抗、FITC标记的羊抗兔荧光Ⅱ抗和DAB显色试剂盒(武汉博士德)；GoTaq 两步法RT-qPCR系统、 GoScript 逆转录酶系统和GoTaq® qPCR Master Mix(Promega)；TRIzol 试剂(Ambion)；兔抗人AQP1抗体、兔抗人VEGF-A抗体和兔抗人COX-2抗体(Santa Cruz)；荧光标记的羊抗兔Ⅱ抗(LICOR)；BCA法蛋白定量试剂盒(上海捷瑞)；原代人腹膜微血管内皮细胞株HUM-CELL-0116 (PriCells)。

2 试验方法

2.1 细胞培养 将原代人腹膜微血管内皮细胞株接种在1%明胶包被的25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，24～36 h后第1次换液，以后每2～3 d换1次液。当细胞生长融合至80%～90%时，用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化，以1∶3传代培养，取第3、4代用于实验。

2.2 细胞鉴定 细胞形态学观察并用免疫细胞化学鉴定其中CD31、Ⅷ因子相关抗原、desmin和细胞角蛋白8的表达。

2.3 实验分组 将细胞分成4组:正常(normal，N)组用含葡萄糖的无酚红RPMI-1640培养基培养；罗格列酮(RGZ)组用含10 μmol/L RGZ的无酚红RPMI-1640培养基培养；GW9662(GW)组用含20μmol/L PPAR-γ拮抗剂GW9662的无酚红RPMI-1640培养基培养；GW+RGZ组用含PPAR-γ拮抗剂GW9662的无酚红RPMI-1640培养基提前作用细胞1 h后，加入含10 μmol/L RGZ的无酚红RPMI-1640培养基继续培养。

2.4 CCK-8比色法检测RGZ对细胞增殖的影响 将细胞以5×107/L密度接种于96孔板，每孔加0.1 mL培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，按照分组情况分别处理细胞24 h、48 h和72 h(设置8个复孔)。弃培养基，每孔加入90 μL无酚红RPMI-1640培养基和10 μL CCK-8液体，置于培养箱中孵育2 h，采用酶联免疫检测仪测定各孔450 nm处吸光度(A450)，进行统计学分析。

2.5 渗透压的测量 4组细胞用无酚红培养基同步培养24 h后，采用渗透压检测仪检测各组培养液的渗透压，4组渗透压分别为301(N组)、310(RGZ组)、313(GW组)和315(GW+RGZ组) mOsm/kg。

2.6 Real-time PCR 检测AQP1、VEGF-A和COX-2 mRNA表达 当细胞生长融合至90%～95%时，按上述分组要求同步培养细胞24 h，采用TRIzol一步法抽提细胞总RNA，用GoScript 逆转录酶系统试剂盒合成cDNA，产物用GoTaq两步法RT-qPCR 系统试剂盒进行PCR扩增。

PCR反应条件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共40个循环；采用2-ΔΔCt法分析real-time PCR结果数据。

2.7 Western blotting 检测AQP1、VEGF-A和COX-2蛋白表达 当细胞生长融合至90%～95%时，按上述分组要求同步培养细胞24 h，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，配置5%的浓缩胶和12%的分离胶，取50 μg变性蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用0.22 μm的硝酸纤维素滤膜进行蛋白质转膜，考马斯亮蓝染胶、丽春红S染液染膜以观察蛋白质是否转移完全。用含5%牛血清白蛋白的封闭液进行封闭，Ⅰ抗(1∶500) 4 ℃孵育过夜，随后荧光标记的羊抗兔Ⅱ抗(1∶10 000)室温避光孵育1 h，Licor Odyssey红色红外成像系统扫描实验结果，最后分析各目的蛋白条带与β-actin蛋白条带灰度值。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞鉴定结果

细胞形态学观察：倒置相差显微镜下观察到细胞呈多边形、星形，呈铺路石样生长。免疫细胞化学鉴定：CD31和Ⅷ因子相关抗原表达阳性，细胞浆染色呈棕黄色，desmin和细胞角蛋白8表达阴性，证实是血管内皮细胞，见图1。

Figure 1.Human peritoneal microvascular endothelial cells were identified at 48 h by immunocytochemistry (×200). A: anti-factor VIII; B: anti-cytokeratin 8; C: anti-CD31; D: anti-desmin.

2 RGZ对人腹膜微血管内皮细胞增殖的影响

我们选择5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L 3个不同的RGZ浓度，real-time PCR 检测AQP1 mRNA表达，发现AQP1表达量在10 μmol/L显著增加，与10 μmol/L相比，20 μmol/L增加幅度较小，故本实验RGZ浓度定为10 μmol/L。我们的研究结果显示：与对照组相比，RGZ在各时点均对人腹膜微血管内皮细胞具有明显的促进增殖的作用(P<0.05)；同时发现，RGZ+GW组在实验的48 h和72 h时点上，均有不同程度的促进增殖作用(P<0.05)，但该组细胞增殖较RZG组低，见图2。

Figure 2.Effect of RGZ on the cell proliferation. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs N group.

3 Real-time PCR 检测AQP1、VEGF-A和COX-2 mRNA表达结果

我们选择1、12、24、48 h共4个时点，real-time PCR 检测AQP1 mRNA表达，发现AQP1表达量在24 h显著增加，故本实验时间定为24 h。与对照组相比，RGZ可以上调人腹膜微血管内皮细胞AQP1 mRNA的表达，而该上调作用能部分被GW9662所拮抗(P<0.05)；RGZ下调VEGF-A和COX-2 mRNA的表达(P<0.05)，但GW9662对VEGF-A及COX-2 mRNA表达无明显影响(P>0.05)，见图3。

Figure 3.Effect of RGZ on the mRNA expression of AQR1,VEGF-A and COX-2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs N group.

4 Western blotting 检测AQP1、VEGF-A和COX-2蛋白表达结果

用兔抗人AQP-1多克隆抗体进行蛋白印迹,可在28 kD处检测到一条带，证实人腹膜微血管内皮细胞表达AQP1。对人腹膜微血管内皮细胞AQP1表达水平的半定量分析结果显示：RGZ可以上调人腹膜微血管内皮细胞AQP1蛋白的表达，而该上调作用能部分被GW9662所拮抗(P<0.05)，见图4。相反的，RGZ下调该细胞VEGF-A及COX-2蛋白表达(P<0.05)，但GW9662对VEGF-A及COX-2蛋白表达无明显影响(P>0.05)，见图5。

讨 论

一直以来，肾脏水转运通道蛋白靶向蛋白质组学被用于确定肾脏水钠重吸收的潜在调节位点。以往的一项动物实验发现RGZ上调肾脏Na+-K+-ATP酶含量，而布美他尼能够抑制Na+-K+-2Cl-协同转运蛋白、Na+/H+交换体3和水通道蛋白2、3的活性，由此可以断定RGZ诱导的钠潴留致使肾小管转运蛋白增加及肾小球滤过率下降[3]。目前有研究提出TZDs诱导一部分病人液体潴留、水肿，但对其诱导液体潴留的机制存在争议。大部分研究表明，该效应是通过肾小管钠和水的重吸收，但具体涉及的肾单位部分和钠运载体的作用尚不明确。有研究提出血管通透性增加可能是PPARγ激动剂造成组织水肿的原因：一项临床试验发现TZDs治疗50例2型糖尿病患者16周后，血红蛋白和血细胞比容减少[4]，证实PPARγ激动剂可能会增加血管通透性。

Figure 4.Effect of RGZ on the protein expression of AQP1 in the cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs N group.

Figure 5.Effect of RGZ on the protein expression of VEGF-A and COX-2 in the cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs N group.

AQP1位于各组织的无孔毛细血管内皮细胞基底膜，包括腹膜，并且AQP1能够促进毛细血管内皮细胞水份的渗透运输。本研究中我们发现RGZ可以促进人腹膜微血管内皮细胞增殖，而在RGZ+GW组人腹膜微血管内皮细胞与正常对照组相比仍有一定程度的增殖，提示我们PPAR-γ拮抗剂GW9662可能部分抑制细胞增殖作用，RGZ还可能通过其它途径促进人腹膜微血管内皮细胞增殖。以往的研究发现RGZ对不同的细胞作用不同，例如RGZ可通过激活p38 丝裂原活化蛋白激酶通路引发人肝癌HepG2细胞周期阻滞；并能抑制干细胞因子诱导的人肥大细胞-1(HMC-1)细胞迁移和纤维连接蛋白诱导的HMC-1细胞黏附，而RGZ对HMC-1细胞的这种作用可以被GW9662所阻断[5]。本研究还发现RGZ可以上调人腹膜微血管内皮细胞AQP1 mRNA及蛋白的表达，而这种上调作用可以部分被PPAR-γ拮抗剂GW9662所拮抗。一项动物实验表明，糖皮质激素也能够上调腹膜微血管AQP1的表达，导致自由水运输显著增加，而RGZ对AQP1的这一作用机制尚不明确。Zhang等[6]通过研究非洲爪蟾蜍卵母细胞表达的野生型AQP1通道，首次提出蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的激活显著增加AQP1依赖的透水性，该AQP1新途径独立于环核苷酸途径，并可能有助于PKC激活后调控AQP1改变，从而调控如内皮渗透性，血管生成，尿液浓缩等过程。

已知PPAR-γ在血管内皮细胞上高表达，激活的PPAR-γ可以抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和血管新生，最近的研究发现TGZ诱导OP9脂肪细胞VEGF的表达，而GW9662抑制TGZ诱导的VEGF表达[7]。在本研究中，我们得到同样的结果：RGZ可抑制人腹膜微血管内皮细胞VEGF-A和COX-2表达，real-time PCR分析结果表明，经RGZ处理后的24h腹膜微血管内皮细胞表达VEGF-A和COX-2 mRNA下降，提示RGZ抑制VEGF-A和COX-2的表达，有可能参与抑制腹膜微血管发育。而对于RGZ影响VEGF-A和COX-2表达可能涉及不同的机制或信号通路：最近的一项研究发现PPAR-γ活化后可能会使细胞变形及大分子漏出，致内皮细胞屏障功能紊乱[8]。和AQP1相似，Scoditti等[9]对人内皮细胞血管新生的研究发现，VEGF可通过PKC依赖途径不完全性诱导细胞cAMP应答元件结合蛋白介导的COX-2表达，而RGZ可通过调控VEGF的表达来部分干预COX-2的表达。另一研究发现15-甲基前列腺素F2和RGZ作用于人子宫内膜细胞，激活的PPAR-γ与VEGF基因启动子区域的应答元件即PPRE序列结合，能够抑制VEGF基因表达和VEGF分泌[10]。另外，体外实验发现RGZ减少VEGF分泌的同时，抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和血管新生，表明RGZ可能通过减少HUVECs分泌VEGF从而实现对HUVECs血管生成的抑制作用。

综上所述，本研究通过体外实验观察了RGZ对人腹膜微血管内皮细胞AQP1、VEGF-A和COX-2表达的影响,发现RGZ可促进人腹膜微血管内皮细胞增殖，上调AQP1的表达，下调VEGF-A及COX-2的表达，而PPAR-γ拮抗剂可部分抑制罗格列酮上调的AQP1表达改变，但对VEGF-A 及COX-2表达无明显影响。RGZ对人腹膜微血管内皮细胞的具体调控机制较为复杂，且RGZ是否通过AQP1、VEGF-A和COX-2影响腹膜功能还有待更进一步的研究证实，是否可以指导临床实践而应用于腹透超滤衰竭的患者更需进一步的临床研究。

[1] Ghosh AK, Quaggin SE, Vaughan DE. Molecular basis of organ fibrosis: potential therapeutic approaches[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2013, 238(5): 461-481.

[2] 聂振禹, 陈争跃, 包蓓艳. 一种改良的尿毒症腹膜透析大鼠模型[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(11):2109-2112.

[3] Song J, Knepper MA, Hu X, et al. Rosiglitazone activates renal sodium and water- reabsorptive pathways and lowers blood pressure in normal rats[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2004, 308(2):426-433.

[4] Berria R, Glass L, Mahankali A, et al. Reduction in hematocrit and hemoglobin following pioglitazone treatment is not hemodilutional in Type II diabetes mellitus[J]. Clin Pharmacol Ther, 2007, 82(3):275-281.

[5] Zhang G, Yang J, Li P, et al. Rosiglitazone inhibits HMC-1 cell migration and adhesion through a peroxisome proliferator-activated receptor gamma-dependent mechanism[J]. Iran J Allergy Asthma Immunol, 2014, 13(1):11-18.

[6] Zhang W, Zitron E, Homme M, et al. Aquaporin-1 channel function is positively regulated by protein kinase C[J]. J Biol Chem, 2007, 282(29):20933-20940.

[7] Kotake D, Hirasawa N. Activation of a retinoic acid receptor pathway by thiazolidinediones induces production of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in OP9 adipocytes[J]. Eur J Pharmacol, 2013, 707(1-3):95-103.

[8] Huang Y, Zhao B, Liu Y, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor γ regulates the expression of lipid phosphate phosphohydrolase 1 in human vascular endothelial cells[J]. PPAR Res, 2014, 2014:740121.

[9] Scoditti E, Massaro M, Carluccio MA, et al. PPARγ agonists inhibit angiogenesis by suppressing PKCalpha-and CREB-mediated COX-2 expression in the human endothelium[J]. Cardiovasc Res, 2010, 86(2):302-310.

[10]Peeters LL, Vigne JL, Tee MK, et al. PPAR gamma represses VEGF expression in human endometrial cells: implications for uterine angiogenesis[J]. Angiogenesis, 2005, 8(4):373-379.

Effect of rosiglitazone on expression of AQP1, VEGF-A and COX-2 in human peritoneal microvascular endothelial cells

CHEN Zheng-yue1, YU Xiong-wei1, NIE Zhen-yu2, ZHAO Yu2, BU Shi-zhong1, BAO Bei-yan2

(1DiabetesCenterofNingboUniversity,RunLiangDiabetesResearchLaboratory,NingboUniversity,Ningbo315211,China;2DepartmentofNeurology,NingboUrologyandNephrologyHospital,Ningbo315192,China.E-mail:baobeiyan2007@sina.com)

AIM: To investigate the effect of rosiglitazone on the expression of aquaporin-1 (AQP1), vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in human peritoneal microvascular endothelial cells.METHODS: Cultured peritoneal microvascular endothelial cells were divided into 4 groups. The morphological changes of the cells were observed under inverted microscope. The protein expression of AQP1, VEGF-A and COX-2 in human peritoneal microvascular endothelial cells was determined by Western blotting. The mRNA expression of AQP1, VEGF-A and COX-2 in the cells was measured by real-time PCR. RESULTS: Rosiglitazone stimulated the proliferation of the cells. Rosiglitazone up-regulated the expression of AQP1, and down-regulated the expression of VEGF-2 and COX-2 at mRNA and protein levels in the cells. The PPAR-γ antagonist GW9662 partly inhibited the up-regulation of AQP1 expression by rosiglitazone (P<0.05), but had no obvious effect on the expression of VEGF-A and COX-2 (P>0.05). CONCLUSION: Rosiglitazone up-regulates the expression of AQP1 and down-regulates the expression of VEGF-A and COX-2 in human peritoneal microvascular endothelial cells, thus promoting water transportation and attenuating peritoneal fibrosis during peritoneal dialysis.

Peritoneal microvascular endothelial cells; Aquaporin-1; Vascular endothelial growth factor; Cyclooxygenase-2; Peroxisome proliferator-activated receptor γ

1000- 4718(2015)01- 0044- 05

2014- 08- 06

2014- 10- 23

浙江省自然科学基金资助项目(No. Y13H050021)； 宁波市卫生局项目(No.2010A18)

△通讯作者 Tel: 0574-83039290; E-mail: baobeiyan2007@sina.com

R363； R329.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.009