环杷明对马兜铃酸诱导的肾上皮细胞表型转化及Hedgehog通路的影响*

洪炜龙， 陆 红， 吴存造， 林成成， 梁 勇， 王斯璐， 陈必成， 白永恒△

(温州医科大学附属第一医院 1外科实验室， 2医学检验中心， 3移植科，浙江 温州 325000)



环杷明对马兜铃酸诱导的肾上皮细胞表型转化及Hedgehog通路的影响*

洪炜龙1， 陆 红2， 吴存造3， 林成成1， 梁 勇1， 王斯璐1， 陈必成1， 白永恒1△

(温州医科大学附属第一医院1外科实验室，2医学检验中心，3移植科，浙江 温州 325000)

目的： 探讨环杷明干预Hedgehog(HH)信号对马兜铃酸(AA)致肾小管上皮细胞表型转化和基质累积的影响。方法: 根据干预措施将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为溶剂对照组、AA损伤组(分别用终浓度为1、5和10 mg/L的AA处理细胞)和环杷明干预组(10 mg/L AA基础上加入1、5和10 μmol/L环杷明)。细胞培养24 h后，用real-time PCR检测HH信号关键分子Ptch1和Smo、表型转化相关分子α-SMA和E-cadherin、ZO-1、BMP-7和基质成分I型和III型胶原mRNA的表达；ELISA法检测Shh和TGF-β1的含量；细胞免疫荧光染色检测Ptch1、Smo、E-cadherin、α-SMA和III型胶原蛋白表达。结果: AA不仅增加了TGF-β1、α-SMA和III型胶原的表达，降低了E-cadherin和ZO-1的表达，而且诱导了Shh和Smo mRNA表达的升高和Ptch1 mRNA表达的下降，提示AA促进小管上皮细胞表型转化和胶原累积，同时也激活了HH信号通路。环杷明干预AA作用后，Smo mRNA或蛋白表达下调，Ptch1 mRNA表达升高，这说明环杷明抑制了AA诱导的HH信号通路的活化。此外，环杷明也降低TGF-β1、α-SMA、I型和III型胶原的表达，提高BMP-7、ZO-1和E-cadherin的表达，这提示环杷明抑制了AA所致的上皮细胞的表型转化和基质累积。结论: 环杷明可抑制AA所致的肾小管上皮细胞表型转化和基质累积，可能是通过靶向抑制HH信号的活化来实现的。

环杷明； 马兜铃酸； 表型转化； 基质累积； Hedgehog信号

前期研究显示，马兜铃酸(aristolochic acid，AA)可诱导肾小管上皮细胞表达和释放TGF-β1，促进上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，最终导致基质成分I和III型胶原的过度累积[1]。在此过程中，损伤的上皮细胞反馈性诱导与增殖相关信号的活化，引起细胞异常增殖可能是EMT和基质累积的关键因素。我们前期实验也证实了AA所致EMT及基质累积过程中Hedgehog(HH)信号被激活[2]。然而，HH信号活化是否为AA所致的肾间质纤维化所必须，且AA损伤肾小管过程中，干预HH信号能否降低基质累积等均尚未明确。本研究拟通过环杷明(cyclopamine，Cyp)特异性阻断HH信号活化，从体外实验角度观察其对AA所致的EMT和基质累积的影响。

材 料 和 方 法

1 细胞、试剂和仪器

大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

马兜铃酸(Sigma)；Cyp (Merck)；DMEM细胞培养液(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶和TRIzol提取液(Gibco)；兔抗鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA) 单克隆抗体(Santa Cruz)；兔抗鼠上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)多克隆抗体(Abcam)；Shh和TGF-β1 ELISA检测试剂盒(上海西唐生物)；real-time PCR试剂(Promega)。

MyCycler梯度PCR仪(Bio-Rad)；7500定量PCR仪(Applied Biosystems)；Varioskan Flash全波长多功能扫描仪(Thermo Scientific)；DM4000 B LED荧光正置显微镜(Leica)。

2 方法

2.1 大鼠肾小管上皮细胞的培养和实验分组 NRK-52E细胞用5%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱培养。实验前，调整细胞至适当密度并铺板于6孔板中，当细胞融合度约为70%时，开始正式实验。实验设立溶剂对照组：不加入AA和Cyp；AA损伤组：细胞培养基中加入10 mg/L AA；Cyp干预组：在10 mg/L AA的基础上，分别加入1、5和10 μmol/L的 Cyp。各组细胞培养24 h后，用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。

2.2 Real-time PCR检测mRNA的表达 采用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA，测定260/280 nm吸光度值以确定纯度和浓度。根据试剂说明书将RNA逆转录成cDNA。针对骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)、Ptch1、Smo、α-SMA、E-cadherin、ZO-1、I型胶原(collagen I)和III型胶原的mRNA设计特异性引物，以GAPDH作为内参照，采用real-time PCR相对定量法进行检测。引物由上海捷瑞公司合成，序列如表1所示。取逆转录产物1 μL进行定量PCR，PCR扩增体系：5 μL 2×SYBR Green荧光定量试剂、上下游引物各1 μL，终浓度为200 nmol/L、1 μL cDNA、2 μL反应缓冲液。扩增程序为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s， 60 ℃ 35 s，40个循环。通过熔解曲线评价PCR结果可靠性，采用2-ΔΔCt计算相对mRNA表达量。

2.3 ELISA检测Shh和TGF-β1的含量 细胞培养24 h，取培养上清液。采用双抗体夹心ELISA法检测TGF-β1和Shh的含量，即预先分别将抗大鼠TGF-β1和Shh单抗包被于酶标板，并特异性地与标准品和样品中的TGF-β1和Shh结合，分别加入生物素化的抗大鼠TGF-β1和Shh，形成免疫复合物连接在酶标板上，并利用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，与加入的底物工作液反应显蓝色，最后加入硫酸终止显色反应，测量在450 nm处的吸光度值(A)，通过绘制标准曲线求出Shh与TGF-β1浓度。

2.4 细胞免疫荧光检测Ⅲ型胶原、α-SMA和E-cadherin蛋白的表达 取对数生长期NRK-52E细胞，分为溶剂对照组、AA损伤组和AA基础上分别加入1、5和10 μmol/L Cyp干预组并进行爬片培养24 h，弃去培养基，用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100破膜。0.5%正常山羊血清封闭。各爬片滴加针对α-SMA、E-cadherin和III型胶原的 I 抗工作液，4℃孵育过夜。用Dylight 488(绿色)或594(红色)标记的 II 抗工作液，37 ℃孵育60 min。滴加DAPI于盖玻片上，室温染色5 min。细胞胞质绿色或红色和胞核蓝色为阳性着色。每组取10张片，每张取10个高倍视野(×400)，用Image-Pro Plus 6.0软件分析荧光累积光密度(IA)值。

表1 扩增HH信号通路、EMT和细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)相关基因mRNA的特异性引物

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，计量资料结果以均数±标准差(mean±SD)表示，两组样本比较采用t检验和精确概率法，多组样本比较采用单因素方差分析，两组样本关联性比较采用相关分析。以P<0. 05为差异有统计学意义。

结 果

1 Cyp对AA诱导肾小管上皮细胞基质累积的影响

细胞免疫荧光染色结果显示，10 mg/L的AA作用NRK-52E细胞后，可显著上调III型胶原蛋白的表达。用Cyp干预后，III型胶原表达水平显著下降，并呈现一定的浓度依赖关系，见图1。Real-time PCR结果显示，AA不仅增加了collagen Ⅲ mRNA的表达，同样也提高了collagen Ⅰ mRNA的表达，见图2。Cyp干预后，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA的表达水平均显著下调。这些结果提示，Cyp能抑制AA所致的基质累积效应。

2 Cyp对AA诱导肾小管上皮细胞EMT的影响

Real-time PCR结果显示，AA下调了E-cadherin和ZO-1 mRNA的表达水平，上调了α-SMA mRNA的表达水平，见图2。细胞免疫荧光染色显示，AA也下调了E-cadherin蛋白的表达，升高了α-SMA的表达，见图3。应用Cyp干预后，E-cadherin和ZO-1表达上调，而α-SMA的表达下降。此外，Cyp上调了表型转化抑制因子BMP-7 mRNA的表达。这些结果显示，Cyp可抑制AA所致的EMT进程。

Figure 1.The expression of type III collagen in the NRK-52E cells induced by AA with or without Cyp treatment (×200). A: control; B: AA 1 mg/L; C: AA 10 mg/L; D: AA 10 mg/L+Cyp 1 μmol/L; E: AA 10 mg/L+Cyp 5 μmol/L; F: AA 10 mg/L+Cyp 10 μmol/L. Mean±SD. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs A group ; #P<0.05, ##P<0.01 vs C group.

3 Cyp对AA诱导的肾小管上皮细胞表达TGF-β1的影响

本实验中，Cyp的干预可有效降低NRK-52E细胞分泌TGF-β1量，并且其抑制作用呈现Cyp浓度依赖性，见图4。

4 Cyp对AA诱导的肾小管上皮细胞HH信号表达的影响

Real-time PCR结果显示，Cyp作用NRK-52E细胞24 h后，随着Cyp浓度增加，Ptch1 mRNA表达量显著上调，Smo 的mRNA表达显著下调，提示HH信号通路被抑制，见图5。细胞免疫荧光染色结果也显示Cyp逆转了AA所致的Smo高表达和Ptch1低表达,见图6。然而，ELISA结果发现，随着Cyp浓度增加，Shh分泌表达量呈现上升趋势(图7)，我们推测这可能与HH信号被阻断后导致信号起始因子Shh的蓄积作用有关。

Figure 2.The mRNA expression of ECM and EMT related molecules in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ## P<0.01 vs AA 10 group.

Figure 3.The expression of E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells induced by AA with or without Cyp treatment (×200). A: control; B: AA 1 mg/L; C: AA 10 mg/L; D: AA 10 mg/L+Cyp 1 μmol/L; E: AA 10 mg/L+Cyp 5 μmol/L; F: AA 10 mg/L+Cyp 10 μmol/L. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs A group; #P<0.05 vs C group.

Figure 4.The contents of TGF-β1 in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L)determined by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs AA 10 group.

讨 论

HH信号通路主要由配体 sonic hedgehog(Shh)、膜受体Patched(Ptch)、信号开关蛋白Smoothened(Smo)及下游的转录因子Gli组成[3]。正常表达的HH信号在器官发育和器官修复再生过程中起着重要作用[4]，但持续异常激活的HH信号可导致胰腺癌等多种肿瘤的发生[5]。

近来有研究报道，HH信号活化也参与了多种组织的纤维化[6-7]。在梗阻性胆管疾病中，HH可被活化，进而促进胆管上皮细胞EMT，最终导致胆管纤维化[6]。我们前期研究也显示，输尿管梗阻诱导大鼠肾间质纤维化过程中，可激活HH信号[7]。活化的HH信号可提高TGF-β1的表达，促进小管上皮细胞向间质细胞转化，最终导致基质成分在肾间质的过度累积。因此，可以从HH信号转导途径上入手，查找信号调控的相关药物，可发挥一定的抗纤维化作用。

最近研究显示，环耙明可调控HH信号的转导，进而抑制肝纤维化[7]。Cyp是一种从藜芦属植物内分离得到的异甾体类生物碱。Cyp可特异性改变Smo空间构象，抑制其活性，从而抑制HH信号通路[8-9]。此外，Cyp与Smo结合能够使细胞的分裂停止于G0/G1期，诱导细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。然而，Cyp调控HH信号活化通过何种机制影响AA所致的纤维化进程尚不清楚。本研究结果显示，AA可上调TGF-β1、Smo、α-SMA、I型和III型胶原的表达，下调BMP-7、E-cadherin、ZO-1和Patch1表达。TGF-β1是一种重要的促纤维化因子，其表达升高可诱导多种上皮细胞发生表型转化和基质累积，E-cadherin和ZO-1均为上皮细胞标志物，而α-SMA为肌成纤维细胞标志物，E-cadherin和ZO-1表达的降低和α-SMA表达的增加提示AA诱导了肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞样细胞转化。Patch1表达的下调和Smo表达的上调则提示HH信号被活化。我们推测，在AA损伤微环境中，损伤严重的上皮细胞可能发生凋亡、坏死、崩解并释放大量炎症因子、趋化因子等细胞因子，诱导周围未受损或受损程度较轻的上皮细胞异常增殖。同时，与增殖相关的HH信号被活化。活化的HH信号推动小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞，而后者能分泌胶原成分在局部累积导致纤维化样改变。应用Cyp可抑制HH信号通路，下调肌成纤维细胞和纤维化相关分子的释放和表达，进而抑制胶原累积降低纤维化样改变。此外，研究也发现，HH通路被抑制情况下，Shh分泌表达量呈现上升趋势，推测可能与HH信号被阻断后导致信号起始因子Shh的蓄积作用有关。

Figure 5.The mRNA expression of Ptch1 and Smo in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AA 10 group.

Figure 6.The expression of Ptch1 and Smo in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment (×400). Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs AA 10 group.

Figure 7.Shh contents in NRK-52E cells induced by AA (mg/L) with or without Cyp (μmol/L) treatment determined by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs AA 10 group.

综上所述，我们初步从体外实验角度揭示Cyp可通过靶向阻断HH信号，下调了AA诱导的TGF-β1的表达和释放，抑制EMT和胶原累积，最终缓解纤维化样改变。然而，Cyp干预HH信号进而发挥抗纤维化作用尚需未来的体内实验予以证实。从信号转导的调控途径上查找有效的治疗药物，在一定程度上可为肾间质纤维化的治疗提供新的思路。

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Effect of cyclopamine on aristolochic acid-induced phenotypic transformation and Hedgehog pathway in renal epithelial cells

HONG Wei-long1, LU Hong2, WU Cun-zao3, LIN Cheng-cheng1, LIANG Yong1, WANG Si-lu1, CHEN Bi-cheng1, BAI Yong-heng1

(1SurgeryLaboratory,2DepartmentofLaboratoryMedicine,3DepartmentofTransplantation,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:greatsailor@163.com)

AIM: To investigate the effect of cyclopamine on Hedgehog (HH) signaling, phenotypic transformation and matrix accumulation induced by aristolochic acid (AA) in renal tubular epithelial cell NRK-52E. METHODS: NRK-52E cells were randomly divided into control group (treated with solvent only), AA group (treated with AA at concentrations of 1, 5, 10 mg/L) and cyclopamine group (treated with AA at concentration of 10 mg/L plus cyclopamine at concentrations of 1, 5, 10 μmol/L). After cultured for 24 h, the mRNA expression of Ptch1, Smo, α-SMA, E-cadherin, ZO-1, BMP-7, type I collagen and type III collagen was quantified by real-time PCR. The protein levels of Shh and TGF-β1 were detected by ELISA. Immunofluorescence staining was used to evaluate the expression of Ptch1, Smo, α-SMA, E-cadherin and type III collagen in the NRK-52E cells. RESULTS: AA increased the expression of TGF-β1, α-SMA and type III collagen, decreased the expression of E-cadherin and ZO-1 protein, and down-regulated the expression of Ptch1， Shh and Smo mRNA in the NRK-52E cells, indicating that AA activated HH signaling, and phenotypic transformation and matrix accumulation occurred in AA-treated NRK-52E cells. Treatment with cyclopamine inhibited HH signaling by decreasing Smo expression and increasing Ptch1 expression. Moreover, cyclopamine also down-regulated the expression of TGF-β1, α-SMA, type I collagen and III collagen, and up-regulated the expression of BMP-7, ZO-1 and E-cadherin. CONCLUSION: AA induces phenotypic transformation and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells, which can be inhibited by cyclopamine treatment. The possible mechanism is that cyclopamine suppresses the activation of HH signaling, resulting in the reduction of epithelial-to-mesenchymal transition and matrix deposition.

Cyclopamine; Aristolochic acid; Phenotype transformation; Matrix accumulation; Hedgehog signaling

1000- 4718(2015)01- 0069- 07

2014- 03- 27

2014- 12- 03

浙江省自然科学基金资助项目(No. LQ12H05001; No. LY12H05004)；温州市科技局项目(No. Y20110028; No. Y20130149)

△通讯作者 Tel： 0577-55579220； E-mail：greatsailor@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.014