低氧诱导神经干细胞凋亡和miR-26a低表达*

李 芳， 魏红艳， 邓宇斌， 李 欣， 李恒杰， 胡春林， 卢远征， 廖晓星△

(中山大学附属第一医院 1急诊科， 2转化医学中心，广东 广州 510080)



低氧诱导神经干细胞凋亡和miR-26a低表达*

李 芳1， 魏红艳1， 邓宇斌2， 李 欣1， 李恒杰1， 胡春林1， 卢远征1， 廖晓星1△

(中山大学附属第一医院1急诊科，2转化医学中心，广东 广州 510080)

目的： 初步探讨氯化钴(cobalt chloride，CoCl2)是否诱导神经干细胞(neural stem cells，NSCs)凋亡及其机制，探讨NSCs凋亡是否引起microRNA-26a(miR-26a)表达变化。方法: 用不同剂量的CoCl2处理NSCs，CCK-8检测细胞活力；TUNEL检测细胞凋亡；建立CoCl2诱导NSCs凋亡的模型，将NSCs分为对照组和凋亡组，real-time PCR检测miR-26a-3p、miR-26a-5p、GSK-3β、Bcl-2、Bax和caspase-3的表达；Western blotting检测Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果: CCK-8结果显示不同浓度(200、400和600 μmol/L)CoCl2作用24 h，NSCs活力呈剂量依赖性下降(P<0.05)。TUNEL检测显示CoCl2(200、400和600 μmol/L)作用24 h后NSCs凋亡率呈剂量依赖性增加(P<0.05)。Real-time PCR和Western blotting结果表明凋亡组miR-26a、GSK-3β、Bax和caspase-3表达增加，Bcl-2、Bcl-2/Bax蛋白水平下降(P<0.05)。结论: CoCl2(400 μmol/L)作用24 h可建立NSCs凋亡模型，其机制可能与线粒体凋亡通路有关；NSCs凋亡时miR-26a表达减少。

氯化钴； 细胞凋亡； 神经干细胞； miR-26a

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新和多能分化潜能，是治疗多种神经系统疾病的希望。但在缺血缺氧性脑病中大脑常严重低氧而使NSCs凋亡增加，自我更新和分化为神经元的能力受限[1]。抑制严重低氧微环境中NSCs凋亡是使NSCs真正发挥作用的关键。然而其机制尚不完全清楚。

MicroRNA-26a(miR-26a)在多种肿瘤中出现表达变化，是调控胆管细胞癌等细胞凋亡和增殖的重要靶点[2]。在大鼠缺氧模型中miR-26a则可调控新生心肌细胞凋亡[3]。miR-26a是否与低氧诱导的NSCs凋亡有关目前却未见报道。氯化钴(cobalt chloride, CoCl2)是公认的缺氧诱导剂，具有使用方便、效果确切等优点，已用于诱导心肌细胞等凋亡[4]。本研究拟初步探讨CoCl2诱导NSCs凋亡及机制，探讨NSCs的凋亡是否与miR-26a有关。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级雌性SD大鼠(孕13.5 d)，由中山大学中山医学院动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2011-0029。

2 主要试剂

DMEM/F12(1∶1)培养基、B27、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、acctuse酶和青、链霉素双抗购自Gibco；免疫细胞化学染色用小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体和GAPDH、Bcl-2、Bax兔抗大鼠Western blotting抗体购自Cell Signaling；细胞核复染试剂Hoechst 33342和TUNEL凋亡试剂盒购自Roche；CoCl2购自Sigma；CCK8试剂盒购自Dojindo；mRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和real-time PCR试剂盒购自TaKaRa。PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司设计和合成，见表1。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1 NSCs的提取、培养和鉴定 取孕13.5 d的SD大鼠胚胎，在冰PBS中机械分离海马组织，离心法收集细胞，并将其重悬于DMEM/F12 (1∶1)培养基中，添加试剂有以下几种：20 mg/L EGF、20 mg/L bFGF、1% B27、2 mmol/L谷氨酰胺、5×103U/L青霉素和5 mg/L链霉素。细胞以2×108/L密度种植在25 cm2培养瓶中，每2～3 d半量换液，根据细胞的生长情况5～7 d传代1 次，传至第3 代细胞用于实验。第3代NSCs培养7 d后在同样的培养基中种植在多聚赖氨酸包被的玻片上，约4 h细胞贴壁后，吸出培养基，用4%的多聚甲醛固定，用0.3%的Triton X- 100通透细胞，并用10%的BSA封闭，用小鼠抗大鼠nestin抗体4 ℃作用16 h，用于标记NSCs的中间丝蛋白，再用荧光Ⅱ抗Alexa Fluor 594室温下作用2 h，用Hoechst 33342染核后，封片固定，用荧光显微镜检测。

3.2 实验分组 用0、200、400和600 μmol/L几种不同浓度的CoCl2干预24 h诱导NSCs凋亡，探讨最佳致凋亡浓度，建立NSCs凋亡模型。分为正常对照组(control)和CoCl2组。

3.3 细胞存活率测定 取对数生长期细胞，以每孔1×104接种于96孔板，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，采用0、200、400和600 μmol/L不同浓度的CoCl2处理NSCs 24 h后与CCK-8孵育4 h，用酶联免疫检测仪测定450 nm处吸光度(A)，按公式存活率(%)=实验组A/对照组A×100%，算出NSCs存活率。同时也采用上述方法检测了400 μmol/L CoCl2作用不同时间的NSCs存活率。

3.4 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测NSCs凋亡 NSCs种于多聚赖氨酸包被的载玻片上，加上述不同浓度的CoCl2处理24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.1% Triton X -100透膜，0.1%柠檬酸钠孵育后，用TUNEL混合液染色，再用Hoechst 33342染核，封片固定，荧光显微镜检测凋亡。凋亡指数=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

3.5 Real-time PCR测定miR-26a、GSK-3β、Bax、Bcl-2和caspase-3的表达 用TaKaRa RNAiso Plus提取RNA。所提RNA 用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测A260/A280在1.8～2.0 之间，并检测浓度，-80 ℃保存备用。检测miR-26a时采用Poly(A)法进行反转录，U6为内参照。用TaKaRa PrimeScript miRNA QPCR Starter Kit Ver. 2.0进行反转录和PCR。于LightCycler 480实时PCR 系统中进行real-time PCR。反应条件为：预变性95 ℃ 30 s；PCR反应：95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40 cycles；熔解曲线分析：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s。GSK-3β、Bax、Bcl-2和caspase-3反转录用TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)完成。取100 ng mRNA茎环引物，用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus)试剂盒于LightCycler 480实时PCR系统中进行real-time PCR。反应条件：预变性95℃ 30 s；PCR反应取定量分析模式，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 cycles； 熔解曲线分析：95 ℃ 5 s；50 ℃ 30 s。β-actin为内参照。用2-ΔΔCt法计算以上各基因相对表达量。

3.6 Western blotting检测 用裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质含量。每个样本取等量蛋白进行SDS-PAGE分离蛋白，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液封闭非特异性抗原结合位点后，加入Bcl-2、Bax、GAPDH的I抗以及相应HRP标记的II抗，ECL进行显色。GAPDH为内参照。

4 统计学处理

数据用SPSS 13.0软件分析。计量资料表示方法为均数±标准差(mean±SD)，两组间比较采用Student’s t test，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 胚胎海马来源NSCs的培养和鉴定

胚胎海马来源的NSCs在DMEM/F12完全培养基中可迅速增殖，培养3～5 d后可形成神经球。免疫荧光染色示我们提取的细胞可表达nestin(NSCs上的中间丝蛋白)，见图1。这表明我们提取的细胞具有NSCs特性。

Figure 1.Identification of the cultured NSCs by observing the immunofluorescence of nestin (×400).

2 CoCl2对NSCs存活率的影响

CCK-8结果显示随CoCl2浓度的增加，NSCs存活率逐渐下降(P<0.05)。200、400和600 μmol/L CoCl2作用24 h，NSCs的存活率分别是77.6%±6.8%、54.2%±8.3%和19.4%±6.1%。400 μmol/L CoCl2作用于NSCs，随作用时间延长，NSCs的存活率降低(P<0.05)。400 μmol/L CoCl2作用12 h、24 h和48 h，NSCs的存活率分别是61.4%±6.9%、51.7%±8.1%、15.7%±4.2%。表明CoCl2对NSCs存活率的影响呈时间和剂量依赖性，见图2。

3 CoCl2致NSCs凋亡

为了检测不同剂量的CoCl2对NSCs凋亡的作用，我们采用了TUNEL法检测了各组NSCs的凋亡率。TUNEL染色显示凋亡的NSCs细胞核呈红色。不同浓度的CoCl2作用24 h后NSCs凋亡率较control组增加(P<0.05)。随CoCl2剂量增加，NSCs凋亡率增加。其中400 μmol/L CoCl2诱导NSCs凋亡较control组增加最明显，见图3。结合CCK-8的结果，我们选取400 μmol/L CoCl2作用24 h制备NSCs凋亡模型进行后续实验。

Figure 3.Apoptosis of the NSCs detected by TUNEL assay(×200). Mean±SD. n= 5. *P<0.05 vs control group.

4 miR-26a在NSCs凋亡模型中低表达

为了检测NSCs凋亡是否与miR-26a有关，我们采用real-time PCR检测CoCl2组和control组miR-26a-3p和miR-26a-5p的表达。结果显示，CoCl2组miR-26a-3p和miR-26a-5p的表达较control组明显下调(P<0.05)，见图4，提示NSCs凋亡增加时miR-26a表达下调，miR-26a可能是调控NSCs凋亡的重要因子。

Figure 4.miR-26a -5p and miR-26a -3p expression in the NSCs treated with 400 μmol/L CoCl2. U6 was used as an internal control. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs control group.

5 NSCs凋亡模型中GSK-3β及凋亡相关蛋白的表达变化

为了检测NSCs凋亡是否与GSK-3β及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达变化有关，我们采用real-time PCR检测CoCl2对GSK-3β、Bcl-2、Bax和caspase-3表达的影响。结果显示CoCl2上调GSK-3β、Bax和caspase-3的表达，而下调Bcl-2的表达(P<0.05)。同时我们采用Western blotting 检测了Bax和Bcl-2表达，结果显示Bcl-2和Bcl-2/Bax较control组表达下调(P<0.05)，而Bax则表达上调(P<0.05)，见图5。

讨 论

CoCl2可诱导多种细胞损伤，本研究CCK-8结果显示CoCl2对NSCs的损伤呈剂量依赖性，CoCl2对NSCs的半抑制浓度是400 μmol/L。但CoCl2对不同细胞的致损伤浓度不同。100 μmol/L CoCl2作用7 d可使少突胶质细胞前体细胞发生慢性缺血缺氧性损伤[5]。200 μmol/L CoCl2处理可建立肝癌细胞缺氧损伤模型[6]。本研究发现400 μmol/L氯化钴作用24 h可建立NSCs凋亡模型。其它研究中CoCl2也是致细胞凋亡的常用试剂。600 μmol/L CoCl2可使PC12细胞凋亡显著增加[7]。以上结果表明，CoCl2可诱导NSCs损伤，可用于建立NSCs低氧损伤和凋亡模型。

Figure 5.The expression of GSK-3β, Bax, BCl-2 and caspase-3. A, B: real-time PCR analysis showed up-regulation of GSK-3β, Bax and caspase-3 and down-regulation of BCl-2. β-actin was used as an internal control. C: Western blotting analysis of Bax and BCl-2 protein expression. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs control group.

本研究通过real-time PCR和Western blotting实验发现CoCl2诱导的NSCs凋亡模型中Bax、caspase-3表达上调，而Bcl-2、Bcl-2/Bax则下调。线粒体凋亡途径在缺血缺氧性脑损伤中起了重要作用[8]。Bax和Bcl-2是线粒体凋亡途径的重要因子，Bcl-2/Bax下降在神经元的凋亡中起关键作用[9]。有文献报道端粒酶反转录酶可通过增加Bcl-2/Bax比率而抑制神经元的凋亡[10]，提示CoCl2诱导NSCs凋亡可能涉及线粒体凋亡通路。

本研究中发现NSCs凋亡模型中miR-26a表达明显下调。miR-26a与多种细胞的存活和凋亡有关。多项研究表明miR-26a促进细胞的增殖，减少细胞凋亡。研究发现miR-26a增加神经胶质细胞瘤的增殖和血管生成[11]。也有研究显示miR-26a抑制小鼠骨骼肌细胞凋亡，促进其分化和增殖[12]。以上结果表明，miR-26a可能成为NSCs凋亡的重要调控因子。

本研究中real-time PCR的结果还表明NSCs凋亡模型中miR-26a减少的同时伴有GSK-3β升高。GSK-3β是一种多功能的激酶，参与了多种细胞凋亡和增殖的调控。文献报道在胆管细胞癌中miR-26a通过抑制GSK-3β的表达而发挥促进肿瘤细胞的增殖和抑制凋亡的作用[2]。在胃癌细胞中GSK-3β过表达也可抑制其增殖[13]。以上结果提示miR-26a可能通过GSK-3β介导的信号通路发挥其在NSCs凋亡中作用，这也是本课题组下一步的研究方向。

综上所述，CoCl2可诱导NSCs凋亡，其机制可能与线粒体凋亡通路有关。miR-26a、GSK-3β可能参与了低氧条件下NSCs凋亡的调控。

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Hypoxia promotes apoptosis of neural stem cells and down-regulates miR-26a

LI Fang1, WEI Hong-yan1, DENG Yu-bin2, LI Xin1, LI Heng-jie1, HU Chun-lin1, LU Yuan-zheng1, LIAO Xiao-xing1

(1EmergencyDepartment,2ResearchCenterofTranslationalMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaowens@163.com)

AIM: To investigate the effect of cobalt chloride (CoCl2) on the apoptosis of neural stem cells (NSCs) and the expression of microRNA-26a (miR-26a)invitro, and to explore the mechanisms of NSC apoptosis induced by CoCl2. METHODS: NSCs were exposed to CoCl2at different doses (200～600 μmol/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were measured by CCK-8 assay and TUNEL method. The expression of miR-26a-3p, miR-26a-5p, GSK-3β, caspase-3, Bcl-2 and Bax was examined by real-time PCR. The protein levels of Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting. RESULTS: The cell viability was inhibited and the apoptosis of NSCs was increased significantly by CoCl2in a dose-dependent manner (P<0.05). CoCl2at concentration of 400 μmol/L for 24 h was used to induce apoptosis and the expression of miR-26a was down-regulated compared with control (P<0.05). Exposure to CoCl2at concentration of 400 μmol/L up-regulated the expression of GSK-3β, caspase-3 and Bax, down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax (P<0.05). CONCLUSION: CoCl2at concentration of 400 μmol/L induces the apoptosis of NSCs obviously. CoCl2may induce the NSC apoptosis by mitochondrial apoptotic pathway. Declining miR-26a may be related to NSC apoptosis.

Cobalt chloride; Apoptosis; Neural stem cells; miR-26a

1000- 4718(2015)01- 0081- 06

2014- 10- 08

2014- 11- 26

国家自然科学基金资助项目(No. 81372023)

△通讯作者 Tel: 020-87331698; E-mail: liaowens@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.016