香烟烟雾对C2C12小鼠成肌细胞HDAC2及炎症介质的影响*

黄冬妹， 何志义， 麻芝英， 肖 影

(广西医科大学第一附属医院呼吸内科，广西 南宁 530021)



香烟烟雾对C2C12小鼠成肌细胞HDAC2及炎症介质的影响*

黄冬妹， 何志义△， 麻芝英， 肖 影

(广西医科大学第一附属医院呼吸内科，广西 南宁 530021)

目的： 探讨香烟烟雾提取物(CSE)对C2C12小鼠成肌细胞组蛋白去乙酰化酶 2(histone deacetylase 2, HDAC2)和炎症介质的影响。方法: CSE刺激C2C12细胞，用质粒脂质体法将构建好的HDAC2 siRNA转染细胞，实时荧光定量PCR和Western blotting法检测HDAC2的表达情况，ELISA检测细胞培养上清白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果: CSE组细胞HDAC2的mRNA及蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，细胞上清IL-8和TNF-α的水平明显高于对照组(P<0.05)；应用HDAC2 siRNA转染细胞后再用CSE刺激细胞，细胞HDAC2的mRNA及蛋白表达均明显低于CSE组及对照组(P<0.05)，细胞释放IL-8和TNF-α的量均明显高于CSE组及对照组(P<0.05)。结论: 氧化应激条件下C2C12小鼠成肌细胞通过下调HDAC2表达使IL-8和TNF-α表达增多。

氧化应激； 组蛋白去乙酰化酶2； 肌萎缩；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)与气道和肺组织对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常慢性炎症反应有关[1]。骨骼肌萎缩是COPD常见的并存病，研究显示COPD病人骨骼肌萎缩可能与肺部炎症引起的全身性炎症反应有关[1-4]。因此我们推测氧化应激一方面可以导致肺部炎症，同时可以引发骨骼肌的炎症，肺部炎症和骨骼肌的炎症具有一致性。目前有关氧化应激对肺部炎症的研究较多，并认为组蛋白去乙酰化酶 2(histone deacetylase 2，HDAC2)与核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在氧化应激所致肺部慢性炎症过程中起重要作用[5]。HDAC2和NF-κB是否也参与了骨骼肌慢性炎症反应，并导致骨骼肌萎缩还有待进一步研究。我们前期研究显示香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)能够使C2C12细胞产生氧化应激，并能明显上调炎症转录因子NF-κB的活性，进而促进炎症介质的释放，炎症负荷的增加抑制了骨骼肌的生长和分化[6]。因此，本研究进一步探讨HDAC2是否也参与了氧化应激下骨骼肌炎症反应。

材 料 和 方 法

1 细胞

小鼠C2C12成肌细胞株(购自中国科学院上海细胞所，由广西医科大学实验中心保存)。

2 主要试剂

DMEM培养基和标准胎牛血清(Gibco)；Lipofectamine 2000脂质体和TRIzol试剂(Invitrogen)；MTT(Sigma)；IL-8和TNF-α ELISA 试剂盒(武汉华美公司)；逆转录试剂盒(TaKaRa)；RIPA 蛋白裂解液(碧云天公司)；BCA 蛋白定量试剂盒和ECL发光底物(Pierce)；HRP标记的小鼠抗GAPDH单克隆抗体(上海康成公司)；小鼠抗HDAC2 抗体(Cell Signaling)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(中杉金桥公司)；所用引物由宝生物工程(大连)有限公司根据设计合成； 香烟为万宝路牌，焦油量11 mg，烟碱量0.8 mg。

3 主要方法

3.1 C2C12细胞的培养与分化 小鼠成肌细胞株C2C12在37 ℃、5%CO2条件下培养，培养基为含10%胎牛血清的高糖DMEM。每2～3 d传代1次。传代后C2C12细胞在含有10%马血清的培养基下可分化成具有收缩功能的肌小管，分化为成熟肌细胞一般需6～7 d，分化好的细胞用于后续实验。

3.2 香烟烟雾提取物制作 采用简易冷凝装置，依靠注射器驱动连续抽吸，将烟雾缓慢通入含有20 mL PBS的密闭玻璃容器中，并不断振荡使香烟烟雾充分溶解。抽吸完20支烟后收集液体，用紫外分光光度计在320 nm波长测得香烟提取物的浓度。MTT法确定CSE对细胞的合适作用浓度。

3.3 siRNA合成 根据HDAC2基因的信息，利用siRNA Designer System按照siRNA干扰片段的设计原则设计siRNA序列，送Life Technologies采用化学方法合成，前期实验筛选出有效片段，正义链为5′-CCACAGCGAUGAGUAUAUCAAGUUU-3′，反义链为5′-AAACUUGAUAUACUCAUCGCUGUGG-3′。

3.4 细胞干预与分组 取对数生长期细胞，接种于24孔板，密度约为1×104cells/well，每组6个复孔。实验分为4个组，分别为：(1)空白对照组：即分化成熟的小鼠成肌细胞组；(2)CSE组：CSE干预细胞24 h；(3)HDAC2 siRNA组：用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染细胞；(4)HDAC2 siRNA+CSE组：先用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染细胞，24 h后用CSE刺激细胞24 h。收集细胞提取RNA及蛋白进行分析，同时收集上清液测定IL-8和TNF-α水平。

3.5 Real-time PCR检测HDAC2 mRNA在细胞中的表达 将上述细胞培养液吸去，每孔加入TRIzol提取总RNA，并逆转录成cDNA。使用Light Cycler实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增。HDAC2的上游引物为5’-AGCCCATGGCGTACAGTCAA-3’，下游引物为5’-GGGATGACCCTGGCCATAATAA-3’，扩增片段长度95 bp；GAPDH上游引物为5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物为5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’，扩增片段长度150 bp。采用20 μL反应体系。反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算各组HDAC2 mRNA相对表达量。

3.6 Western blotting 法检测HDAC2蛋白的表达 用移液管吸去各组培养基，各组细胞经PBS洗涤3次后，用胰酶消化细胞，加入培养基终止消化并将细胞吹打下来。将消化下来的细胞悬液移至预冷的10 mL离心管，1 000 r/min，4 ℃离心10 min。弃上清，按RIPA裂解液说明书提取总蛋白，BCA试剂盒对提取的蛋白进行定量，取等量蛋白50 μg进行SDS-PAGE后转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭1 h后，分别以HRP标记的小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1∶10 000)，小鼠抗HDAC2抗体(1∶1 000)冰上孵育过夜，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)与膜室温孵育1 h，GAPDH不孵育Ⅱ抗。暗室胶片曝光显影、定影。Bio-Rad公司的全自动扫描仪扫描胶片，Quantity One 软件分析结果。

3.7 各组细胞上清液IL-8和TNF-α的测定 收集各组细胞上清液，运用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法测定各组细胞上清液IL-8和TNF-α的水平，具体操作步骤按照试剂盒的说明书进行。

4 统计学处理

应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTT法确定不同浓度CSE对细胞活性的影响

CSE作用细胞24 h，0.1%和0.2%CSE对C2C12细胞生长无明显影响(P>0.05)，浓度为0.4%时细胞生长活性明显受抑制(P<0.05)。CSE作用细胞48 h，0.1%浓度的CSE对C2C12细胞生长无明显影响(P>0.05)，浓度为0.2%和0.4%时细胞生长活性明显受抑制(P<0.05)。CSE作用细胞72 h，0.1%、0.2%和0.4%浓度的CSE均明显抑制细胞生长(P<0.05)，见表1。故本实验以CSE合适终浓度0.2%作用细胞24 h进行干预。

表1 不同浓度CSE干预下C2C12细胞各时点的A值

*P<0.05vscontrol.

2 各组细胞HDAC2 mRNA 表达水平

CSE组、HDAC2 siRNA组和HDAC2 siRNA+CSE组HDAC2 mRNA表达水平均明显低于对照组(P<0.05)，HDAC2 siRNA+CSE组HDAC2 mRNA表达水平明显低于CSE组(P<0.05)，见图1。

3 Western blotting法检测各组细胞的HDAC2 蛋白表达

Western blotting 检测结果显示，CSE组、HDAC2 siRNA组以及HDAC2 siRNA+CSE的组HDAC2蛋白表达均低于对照组，HDAC2 siRNA+CSE组低于CSE组；用各组条带的HDAC2灰度值比各组的GAPDH灰度值得到各组HDAC2蛋白相对表达量，CSE组、HDAC2 siRNA组以及HDAC2 siRNA+CSE组的HDAC2蛋白相对表达量均低于对照组，HDAC2 siRNA+CSE组低于CSE组(P<0.05)，见图2。

Figure 1.The mRNA expression of HDAC2 in the C2C12 cells with different treatments. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

Figure 2.The relative protein expression of HDAC2 in the C2C12 cells with different treatments. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

4 各组细胞培养液炎症介质表达水平

4.1 各组细胞释放IL-8水平 CSE组和HDAC2 siRNA组细胞释放IL-8的水平与对照组相比明显增高(P<0.05)。siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激细胞，细胞释放IL-8的水平与CSE组相比明显升高(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The IL-8 level in the cell supernatant.Mean±SD. n= 3.#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

4.2 各组细胞释放TNF-α水平 CSE组和HDAC2 siRNA组细胞释放TNF-α的水平与对照组相比明显增高(P<0.05)。siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激细胞，小鼠成肌细胞释放TNF-α的水平与CSE组相比明显升高(P<0.05)，见图4。

Figure 4.The TNF-α level in the cell supernatant.Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

讨 论

香烟以及其它有害颗粒导致的肺部异常炎症反应不仅局限在肺部而且累及到全身多处器官，引起骨骼肌病变、心血管病变等，同时加重COPD疾病的进展[7-8]。骨骼肌是COPD系统性损伤最主要的受累器官，表现为肌肉萎缩和功能障碍[9]。研究显示COPD病人骨骼肌萎缩与全身性炎症反应密切相关[10-11]。目前认为COPD可能是一种全身炎症反应综合症，香烟所导致的氧化应激使肺部产生异常过多的炎症介质以及炎症因子(IL-8、 TNF-α、MMP-9等)溢出到循环中产生的系统性炎症可能是导致系统性病变及骨骼肌萎縮的直接原因[12-13]。

本实验结果显示，用CSE刺激小鼠成肌细胞C2C12，细胞HDAC2的表达减少，释放IL-8和TNF-α的水平升高；而用HDAC2 siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激细胞，HDAC2的表达减少更加明显，释放IL-8和TNF-α的水平显著升高。这表明CSE刺激小鼠成肌细胞C2C12可以下调HDAC2的表达，而沉默HDAC2基因后，CSE下调HDAC2的作用更为明显，炎症介质的释放显著增多。这与COPD肺部炎症机制具有相似性，COPD病人骨骼肌炎症可能是肺部炎症溢出的结果。有研究显示COPD病人肺组织和肺泡巨噬细胞HDAC2的活性和表达都下降，IL-8启动子处的组蛋白乙酰化水平增高[5]。另外，大量研究表明在COPD肺部氧化应激引起的HDAC2下降使得组蛋白乙酰化活性增强，进而引起DNA双链打开，使得炎症转录因子NF-κB等易与DNA结合，启动炎症基因转录过程，从而炎症介质释放增加[5]。本研究结果显示HDAC2在CSE引起的小鼠成肌细胞炎症反应中起到重要作用， HDAC2是否是通过NF-κB调控IL-8和TNF-α等炎症介质的释放还需进一步深入研究。

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Effect of cigarette smoking condensate on HDAC2 and inflammatory mediators in mouse myoblast C2C12 cells

HUANG Dong-mei, HE Zhi-yi, MA Zhi-ying, XIAO Ying

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:zhiyi-river@163.com)

AIM: To investigate the effect of cigarette smoking condensate on histone deacetylase 2 (HDAC2) and inflammatory mediators in mouse myoblast C2C12 cells. METHODS: C2C12 cells were treated with cigarette smoke extract (CSE).HDAC2 siRNA was transfected into the cells using LipofectamineTM2000. The levels of interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the culture supernatants were measured by ELISA, and the expression of HDAC2 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blotting. RESULTS: The expression of HDAC2 at mRNA and protein levels in CSE group was lower than that in control group (P<0.05). The supernatant levels of IL-8 and TNF-α in CSE group were significantly higher than those in control group (P<0.05). When the cells were transfected withHDAC2 siRNA followed by CSE stimulation, the expression of HDAC2 at mRNA and protein levels was decreased, and the supernatant levels of IL-8 and TNF-α were significantly increased as compared with CSE group and control group (P<0.05).CONCLUSION: Under the oxidative stress condition, C2C12 cells generate high levels of IL-8 and TNF-α by down-regulating the expression of HDAC2.

Oxidative stress; Histone deacetylase 2; Muscular atrophy; Chronic obstructive pulmonary disease

1000- 4718(2015)01- 0008- 04

2014- 09- 03

2014- 10- 14

国家自然科学基金资助项目(No.81260012； No.81160009)

△通讯作者 Tel： 0771-5356702； E-mail: zhiyi-river@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.002