野百合碱诱导大鼠肺动脉高压时对肺血管壁Jagged2/Notch3信号分子表达的影响*

常 成， 靳 鹏， 郑 薇， 康华利， 邓梦杨， 李双菲， 武晓静

(第三军医大学附属新桥医院全军心血管病研究所，重庆 400037)



野百合碱诱导大鼠肺动脉高压时对肺血管壁Jagged2/Notch3信号分子表达的影响*

常 成， 靳 鹏， 郑 薇， 康华利， 邓梦杨， 李双菲， 武晓静△

(第三军医大学附属新桥医院全军心血管病研究所，重庆 400037)

目的： 观察野百合碱诱导大鼠肺动脉高压时肺血管壁Jagged2/Notch3信号分子表达的变化，探讨Jagged2/Notch3信号在肺动脉高压发生中的作用和意义。方法: 45只SD大鼠随机分为正常对照组(C组)、溶剂对照组(S组)和野百合碱模型组(M组)，每组15只，通过一次性腹腔注射野百合碱50 mg/kg建立肺动脉高压模型，溶剂对照组注射相同剂量的溶媒。4周时通过HE染色观察肺血管重构，通过右心导管测定平均肺动脉压(mPAP)和右心室收缩压(RVSP)。采用免疫组化和实时荧光定量PCR等方法检测肺血管壁Jagged2/Notch3/Hes5蛋白和mRNA表达的变化。结果: 与正常对照和溶剂对照组相比，4周时野百合碱模型组的血管壁显著增厚，中膜厚度百分比增加(P<0.01)；此外野百合碱模型组的mPAP和RVSP显著高于正常对照和溶剂对照组(P<0.01)；免疫组化和实时荧光定量PCR结果提示Jagged2主要表达于肺小动脉内膜，Notch3、Hes5主要表达于肺小动脉中层平滑肌，与溶剂对照组以及正常对照组相比，野百合碱模型组肺小动脉的Jagged2、Notch3和Hes5表达显著增高。结论: Jagged2/Notch3信号分子的激活可能在野百合碱诱导肺动脉高压发生中起重要作用。

肺动脉高压; 肺血管重构; 野百合碱; Jagged2/Notch3信号分子

肺动脉高压以肺血管阻力进行性增高为主要特点，是一种涉及多种病因的肺血管疾病。然而，临床上引起肺动脉高压的病因虽多，但不论何种原因引起的肺动脉高压，均以肺血管重构为基本病理基础，且肺血管重构是不同病因触发肺动脉高压形成后，肺动脉高压得以维持并迅速进展的共同机制[1]。

已有研究表明，Notch信号影响胚胎血管动静脉分化和成体血管重构，是调节血管形态结构改变的基本信号机制之一[2]。Li等[3]和Thistlethwaite等[4]发现多种病因导致肺动脉高压发生时，肺血管平滑肌Notch3表达增强，提示Notch3信号可能在肺血管重构中起重要作用，但其激活机制不清。参与Notch信号调节的配体有Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4，有研究发现缺氧使肺动脉内皮的Jagged2表达选择性升高[5]，我们推测Notch3可能被Jagged2激活，在肺动脉高压发生中起重要作用。本实验拟通过观察野百合碱诱导大鼠肺动脉高压时肺血管壁Jagged2/Notch3信号分子表达变化，探讨Jagged2/Notch3信号在肺动脉高压发生中的作用和意义。

材 料 和 方 法

1 实验动物、主要试剂和仪器

6～8周龄雄性SD大鼠45只，体重180～200 g，购自第三军医大学第二附属医院新桥医院实验动物中心。

野百合碱(monocrotaline，MCT)购自Sigma；免疫组化染色试剂盒、PBS 液(北京中杉金桥生物技术有限公司)； Total RNA提取试剂、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR® Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)；兔抗大鼠Notch3和Hes5多克隆抗体购自Abcam；兔抗大鼠Jagged2多克隆抗体购自Santa Cruz；PowerLab八通道生理记录仪(澳大利亚AD仪器国际贸易上海有限公司)；实时荧光定量PCR测定仪(ABI)；核酸蛋白检测仪(Coulter)；冰冻切片机(Leica)；倒置相差显微镜(Olympus)。

2 方法

2.1 肺动脉高压模型的建立和分组 野百合碱用乙醇和生理盐水(2∶3)配制成1%的水溶液使用[6]。将45只大鼠随机分为正常对照组(C组)，溶剂对照组(S组)，野百合碱模型组(M组)；所有大鼠常规饲养, 饮食条件相同。实验大鼠饲养在重庆新桥医院动物中心, 光照12 h明暗交替。模型组一次性腹腔内注射MCT 50 mg/kg；溶剂对照组注射同等剂量的溶剂；正常对照组不做任何处理，大鼠常规给予食物和水，饲养4周，4周后空气栓塞法处死大鼠。

2.2 观测指标及检测方法 血流动力学监测：野百合碱注射后第4周，记录大鼠体重，测定其平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)和右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)。大鼠经浓度为2%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后, 将导管插入右颈外静脉, 缓慢进入右心房, 导管内加入肝素盐水，由压力传感器连至多导生理记录仪，依据计算机屏幕显示的图像和波幅的变化, 区别导管尖端所处的位置，根据压力波形观察测定mPAP和RVSP。记录数据后利用栓塞法处死大鼠, 分离出右心室(right ventricle，RV)、左心室(left ventricle，LV)及室间隔(septum ventriculorum，S)，用滤纸吸去血液、盐水，分别称量RV和LV+S的重量，RV/(LV+S)即为右心肥大指数(RVI)。

2.3 肺组织取材 配制冰生理盐水，完成肺动脉压测量后,由肺动脉灌洗肺血管中的血液，用眼科弯镊沿肺动脉主干迅速剥离出肺动脉主干和肺内部分动脉，取下的组织标本立即置入液氮中冻存以备目的基因和蛋白检测，后取出左肺下叶外侧部分并用4%多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋后切片(5 μm)，用于HE染色和蛋白免疫组织化学检测。

2.4 HE染色 肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，HE染色，脱水透明后，中性树胶封片，显微镜下观察肺血管大体形态变化。采集图像后采用Image Pro Plus Analysis 软件分析，用光标勾划出内、外弹力板的轮廓，分别测定内、外弹力板的平均直径，计算内、外弹力板之间的厚度为肺小动脉的中膜厚度(wall thickness，WT)和血管的外弹力板的平均直径(external diameter，ED)。根据公式计算中膜厚度百分比：WT%=(2×WT/ ED)×100% 。

2.5 Real-time PCR 所用引物由Primer 5.0软件设计，TaKaRa生物技术有限公司合成，序列见表1。RNAiso Plus提取总RNA，20 μL 体系中进行反转录，50 μL 体系中进行扩增。按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书提供的方法进行逆转录，再以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增采用两步法,条件如下：95 ℃ 30 s；然后按95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共45个循环。反应完成后，得到所有标本的记录曲线。软件将自动进行数据分析，调整基线，计算出Ct值。相对定量公式及表达量计算按文献所述[7]。

表1 Jagged2、Hes5、Notch3 和 GAPDH的引物序列

2.6 免疫组织化学实验 肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，滴加30 g/L过氧化氢，室温下湿盒中封闭12 min, 以消除内源性过氧化物酶活性，0.1 mol/L PBS洗片5 min 3次, 正常山羊血清工作液封闭，室温下孵育30 min，甩去血清，不洗，滴加1∶100稀释的多克隆 I 抗，4 ℃孵育过夜，0.1 mol/L PBS洗片5 min 3次；滴加生物素标记的 II 抗工作液，37 ℃孵育40 min，PBS洗片5 min 3次；滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，37 ℃孵育40 min，PBS洗片5 min 3次；DAB显色剂显色1～2 min，苏木精复染，脱水透明后，中性树胶封片。显微镜下观察肺动脉Jagged2/Notch3和Hes5的表达结果。

3 统计学处理

所有数据应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析。右心肥厚指数(RVI)和中膜厚度百分比(WT%)的相关性采用Pearson线性相关分析。

结 果

1 肺动脉高压模型大鼠变化

4周时，正常组及溶剂组大鼠体重增加，毛发光泽，反应灵敏；模型组注射MCT后，大鼠逐渐出现毛发暗淡无泽、皮肤瘀斑、活动减少、呼吸急促、肝腹肿大、体重减轻和反应迟钝等表现。实验动物死亡情况：模型组于实验第2 天、第20 天及第24 天各死亡1只。在进行血流动力学检测时，正常组1只大鼠因心律失常死亡；溶剂组2只大鼠因麻醉意外中死亡，余均完成了肺动脉压力的检测。最终模型组12只，溶剂组13只，正常组14只。

2 肺血流动力学的各项指标变化

注射MCT 4周后，大鼠肺动脉高压模型成功建立，模型组mPAP、RVSP、RVI、WT%等指标均较正常对照组和溶剂对照组明显升高(P<0.01)，见图1、表2。另外作RVI和WT%相关性分析显示相关性具有统计学意义。可以认为右心肥厚变化和血管中膜肥厚间存在相关关系。

Figure 1.The pulmonary hemodynamics in the rats with MCT treatment for 4 weeks. Mean±SD. n=12～14.**P <0.01 vs C and S．

表2 正常组、溶剂组及MCT组大鼠RVSP、mPAP、RVI、WT%的比较

**P<0.01vscontrol group and solvent group.

3 病理学观察HE染色

取大鼠肺组织进行HE染色，可见正常组及溶剂组管壁较薄，管腔通畅，未见狭窄。与正常组及溶剂组相比，模型组中小肺动脉血管内皮层明显增生，中膜明显增厚，平滑肌细胞增生，内、外弹力纤维层均明显增厚，管腔缩小，部分无肌型血管肌化现象严重，甚至可见血管腔完全闭塞等血管丛样改变，见图2。

4 免疫组化定位定量分析蛋白表达

免疫组织化学检测正常组及溶剂组小动脉血管内膜可见少量Jagged2表达，中膜平滑肌层也可见少量的Notch3、Hes5表达。与正常组及溶剂组相比，模型组中小动脉Jagged2、Notch3、Hes5表达均明显增高，Jagged2主要表达于小动脉血管内膜，Notch3、Hes5主要表达于小动脉平滑肌层。另外血管壁周边的肺泡组织部分也可见少量的Jagged2、Notch3、Hes5表达，见图2。

5 荧光定量PCR分析mRNA表达

核酸检测仪检测RNA纯度，A260/A280比值为1.80～2.00，表明RNA纯度较高。采用real-time PCR检测大鼠肺血管及组织中Jagged2、Notch3及Hes5 的mRNA表达，以GAPDH作为内参照，C、S、M组Notch3基因相对表达量分别为0.992±0.038、0.998 ±0.001、1.708±0.133；Jagged2基因平均相对表达强度分别为0.992±0.016、0.998±0.001、10.270±0.254；Hes5基因平均相对表达强度分别为0.982±0.016、0.998±0.001、1.803 ±0.278。图中显示模型组肺血管及部分组织中Jagged2、Notch3、Hes5的 mRNA相对表达量显著高于溶剂组和正常组(P<0.01)，溶剂组和正常组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

讨 论

肺高血压病因多样，遗传、基因变异、缺氧、左心疾病、血栓栓塞等多种原因均可引起肺动脉高压，其发病机制复杂，涉及基因变异、炎症、离子通道、多种信号转导通路等多种机制[8]。近年发现Notch信号通路可能在肺高血压发生发展中起重要作用。本实验通过MCT腹腔注射法建立肺高血压模型，发现4周时,大鼠肺动脉压力显著升高,出现显著的肺小动脉增厚和右心室肥厚, 说明肺高血压大鼠模型建立成功。通过免疫组化和实时荧光定量PCR等方法发现，模型组大鼠和两对照组大鼠肺组织及血管都有Jagged2、Notch3和Hes5的表达，且Jagged2主要表达于血管内膜，Notch3 、Hes5主要表达于血管中层。与对照组相比，MCT诱导的肺高压大鼠肺组织及血管Jagged2、Notch3 和Hes5的表达显著增高。

Notch信号是一个分化保守的跨膜信号通路, 通过其细胞内的信号通路级联影响细胞分化、增殖和凋亡，最终决定细胞命运，影响器官形成和形态发生等[9]。其中在肺发育过程中，对调控肺泡上皮的分化发育起关键作用[10]。本研究中我们也发现肺小动脉周边的肺泡部分也可见到Notch信号分子的表达。在哺乳动物存在4种Notch受体，即Notch 1、2、3、4。Notch受体的跨膜蛋白由胞外段、跨膜段和膜内段组成。Notch3基因是在哺乳动物中发现的第3个Notch家族成员，其明显区别于其它Notch家族成员在于胞内段的转录激活区(transactivation domain, TAD)，相比Notch1、2, 其TAD段更短，转录激活性能较弱，因此命名为Notch3基因。起初发现其主要表达在增殖的神经上皮细胞上[11]，后来发现Notch3也表达在哺乳动物的血管系统。作为重要的信号受体蛋白，Notch3特异性表达于成熟的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)，参与血管发生及分化，在小动脉发育和形成时调节VSMCs的分化与成熟，在病理状态下调节VSMCs的表型转化参与血管重构。研究发现Notch3主要通过Hes5途径介导肺动脉平滑肌增殖和肺血管重构，并且肺动脉高压的严重程度与肺血管Notch3/Hes5活化和Notch3、Hes5蛋白表达量呈正相关[12-13]。鼠的胚胎期缺失Notch3将会导致血管平滑肌缺失和血管壁变薄。Notch3信号通路不仅控制着肺动脉平滑肌细胞的分化增殖，而且维持着使平滑肌细胞在一个未分化状态。例如，应用γ分泌酶抑制剂N-S-苯基甘氨酸丁酯特异性阻断肺血管平滑肌Notch3信号通路，可成功逆转肺动脉高压；同时，Hes5和Notch3基因沉默小鼠不会出现肺动脉高压，而高表达的Notch3增强了平滑肌细胞的增殖。目前研究发现，Notch的配体有5种, 即Delta-like 1、3、4 和Jagged-1、2[14]。Delta-like与Jagged 均为单次跨膜糖蛋白，都属于Deha，Serrate，Lag-2(DSL)蛋白家族，与Delta-like不同，Jagged胞外区还有1个富含半胱氨酸的区域(cysteinerich，CR)，Delta-like无CR区。Jagged2有16个EGF样重复区，Delta1、Delta3和Delta4分别具有8、6及8个EGF样重复区[15]。其通过与Notch受体胞外段富含表皮生长因子样重复片段结合发挥效应,从而调节细胞和组织生成，维持机体正常生理功能，病理条件下参与炎症过程，调控肿瘤发生发展[16]。Notch与配体结合后，在其跨膜区有一金属蛋白酶作用位点，切割下来的胞外段将被表达配体的细胞内吞消化分解；跨膜区近胞内段有γ-secretase作用位点，释放Notch胞内段(Notch intracellular domain，NICD)。NICD转移到细胞核，与CBF-1异二聚体化，调控相应基因表达，影响细胞生物学行为[17]。经典的Notch信号是通过侧抑制的方式调节相邻细胞的活动，近来发现在血管壁其主要通过改变血管细胞自分泌或旁分泌的方式参与血管结构和功能的调节[18]。

Figure 2.Pathologic morphology and protein expression of Jagged2, Notch3 and Hes5 in the rats. Mean±SD. n=12～14. **P<0.01 vs C and S.

然而，在肺循环疾病和肺动脉高压进展过程中，Notch3是被何种配体激活的目前尚未见相关报道。有研究表明缺氧引起的肺血管重构时缺氧使肺血管内皮Jagged2表达特异性升高。在本实验中，同样MCT诱导的肺动脉高压大鼠肺血管Jagged2和Notch3表达明显增高，与对照组相比差异有统计学意义。这些结果表明Jagged2/Notch3-Hes5信号分子可能在MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型肺血管重构中具有重要作用。两者的协同高表达可能诱发了内皮和平滑肌细胞的增殖，进而促进了肺动脉高压的发生发展。Shimizu等[19]采用细胞结合分析法在实验中证明Jagged2是Notch3的配体，有激活Notch3的作用，提示在肺动脉高压的发生过程中，肺动脉内皮细胞Jagged2表达升高，可能通过刺激或抑制内皮细胞分泌活性物质，进而激活肺动脉平滑肌细胞Notch3/Hes5信号，最终促进肺动脉平滑肌表型转换和肺血管重构，导致肺高血压的发生。此外，Jagged2在激活Notch3的过程中是否与其它受体Notch3、Notch4和配体Jagged1，Delta1、2、3有交叉联系，它们如何参与肺动脉高压的发生过程，以及Jagged2对Notch3可能的激活效应是否在其它病因形成肺高血压的发病机制中也起一定的作用，仍不清楚，尚需进一步研究。

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Expression of Jagged2/Notch3 signaling molecules in pulmonary hypertensive rats induced by monocrotaline

CHANG Cheng, JIN Peng, ZHENG Wei, KANG Hua-li, DENG Meng-yang, LI Shuang-fei, WU Xiao-jing

(CardiovascularInstituteofXinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China.E-mail:xiaojingwu1992@163.com)

AIM: To study the expression of Jagged2/Notch3 signaling molecules in pulmonary vascular wall of pulmonary hypertensive rats induced by monocrotaline. METHODS: SD rats were randomly divided into normal control group (C group,n=15), solvent control group (S group，n=15) and monocrotaline model groups (M group，n=15). The model of pulmonary hypertension was established by a single subcutaneous injection of monocrotaline (50 mg/kg). The rats in S group were given a single subcutaneous injection of the same dose of solvent. After 4 weeks, the pulmonary vascular remodeling was assessed by HE staining, and the mean pulmonary artery pressure (mPAP) and right ventricular systolic pressure (RVSP) were determined by right heart catheterization. The expression of Jagged2/Notch3 /Hes5 molecules in the pulmonary vascular wall was detected by immunohistochemical method and real-time PCR. RESULTS: Compared with S group and C group, the percentage of medial wall thickness of smaller arteries in model group increased significantly (P<0.01). The levels of mPAP and RVSP in M group were significantly higher than those in S group and C groups (P<0.01). The results of real-time PCR showed that the expression of Jagged2, Notch3 and Hes5 was significantly increased in M group compared with S group and C group. The data from immunohistochemical detection indicated that Jagged2 mainly expressed in the intima of small lung artery, Notch3 and Hes5 mainly expressed in the medial smooth muscle cells. Compared with S group and C group, the expression of Jagged2 and Notch3 was significantly increased in the lung small arteries of M group. CONCLUSION: The activation of Jagged2/Notch3 signaling pathway might play an important role in the formation of pulmonary hypertension.

Pulmonary hypertension; Pulmonary vascular modeling; Monocrotaline; Jagged2/Notch3 signaling molecule.

1000- 4718(2015)01- 0012- 06

2014- 09- 11

2014- 11- 12

国家自然科学基金资助项目(No. 81270109；No. 30872710)

△通讯作者 Tel： 23-68774559； E-mail: xiaojingwu1992@163.com

R541.5; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.003