扶肾降浊方含药血清对肾小管间质损害大鼠成纤维细胞抗纤维化因子HGF和BMP-7的影响*

李春雨， 魏晓露， 苏玮莲， 李国霞

(天津医科大学国际医学院，天津 300070)



扶肾降浊方含药血清对肾小管间质损害大鼠成纤维细胞抗纤维化因子HGF和BMP-7的影响*

李春雨， 魏晓露， 苏玮莲， 李国霞△

(天津医科大学国际医学院，天津 300070)

目的： 探讨扶肾降浊方对系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)大鼠肾小管间质损害的疗效及机制。方法: 采用扶肾降浊方水溶液灌胃Wistar大鼠常规制备含药血清，在MsPGN动物模型的基础上，延长造模时间至20周，使其自然发展为肾小管间质损害模型，体外培养造模12、16和20周末大鼠间质成纤维细胞，采用real-time PCR和Western blotting法检测扶肾降浊方含药血清对病理状态间质成纤维细胞中抗纤维化因子肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)mRNA及蛋白表达的影响。结果: 病理状态间质成纤维细胞中抗纤维化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表达下调，扶肾降浊方含药血清随着给药周期的延长可部分逆转间质损害造成的上述mRNA和蛋白表达异常。结论: 扶肾降浊方含药血清对MsPGN大鼠间质成纤维细胞的保护作用可能与调节抗纤维化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表达有关。

扶肾降浊方； 肾间质成纤维细胞； 血清药理学方法； 肝细胞生长因子； 骨形态发生蛋白-7

肾小管间质损害是肾小球肾炎由炎症启动进展至肾小球硬化的中间环节，肾小球肾炎进展至肾小球硬化，大多已不可逆转，而对其中间环节即肾小管间质损害进行早期有效干预则可大大延缓肾小球肾炎进展，对防治慢性肾脏疾病具有重要意义[1-2]。扶肾降浊方在临床广泛用于慢性肾脏疾病的治疗，多年的临床实践取得了总有效率82.5%的疗效[3]。动物实验表明，扶肾降浊方(Fushen Jiangzhuo formula，FSJZ)能改善慢性肾功能衰竭大鼠的常规生化指标，延缓肾衰的病理进程[4]。但对肾小管间质损害的保护作用机制尚不十分清楚。本文在前期研究的基础上采用血清药理学的研究方法，基于抗纤维化因子肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)，从体外细胞实验角度，探讨扶肾降浊方对系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)肾小管间质损害的保护作用机制。

材 料 和 方 法

1 药物、试剂、仪器和动物

扶肾降浊方组成：山茱萸12 g，生黄芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹参30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，实验所用中药制剂为天津中医药大学中药学院按既定工艺制备的配方颗粒，每克含生药4.06 g，批号为20120810；葡萄球菌肠毒素B由军事医学科学院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为Sigma产品；牛血清白蛋白(BSA)为AMRESCO产品；Trizol Reagent、反转录试剂盒及real-time PCR试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；全蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE试剂盒、Western blotting检测试剂盒和ECL化学发光底物试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

DMI4000B倒置荧光显微镜(Leica)；电泳仪购自大连竞迈生物科技有限公司；DH-2000凝胶图像采集分析系统购自Heraeus；ABI 7500型实时荧光定量基因扩增仪为美国应用生物系统公司产品。

雄性Wistar大鼠12只，体重(150 ± 10)g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供，合格证号为SCXK(军)2009-003。

2 方法

2.1 含药血清的制备 Wistar大鼠6只随机分为扶肾降浊方组(3只)和空白对照组(3只)。扶肾降浊方组以每千克51.5 g生药剂量(成人剂量15倍)灌胃给药，每日2次(空白对照组给予等体积生理盐水)连续3 d，于末次给药后1 h腹主动脉取血，静置30 min，3 000 r/min 离心20 min分离血清，56 ℃水浴30 min灭活血清，0.22 μm滤膜除菌，-20 ℃保存备用。

2.2 病理状态间质成纤维细胞的培养 参照文献复制MsPGN大鼠动物模型[5-6]。6只Wistar大鼠随机分为模型组(3只)和空白对照组(3只)，自实验第1天起，模型组大鼠以20 mg BSA配成水溶液，隔日灌胃1次，空白对照组给予等体积生理盐水，隔日灌胃1次，共12～20周。实验的第1天模型组分点注射完全弗氏佐剂0.2 mL(含BSA 2 mg)、第8 天注射不完全弗氏佐剂0.2 mL(含BSA 2 mg)，实验的第8天和15天分别经尾静脉注射金黄色葡萄球菌肠毒素B水溶液(0.4 mg/kg)各1次。空白对照组注射等体积生理盐水。经Masson染色研究证实本实验MsPGN大鼠动物模型复制成功。取第12、16和20周的模型大鼠间质成纤维细胞进行培养，同时培养正常大鼠间质成纤维细胞作为空白对照。无菌条件下，将富含小管间质的肾组织剪碎成1 mm×1 mm×1mm小块，经PBS洗涤，胰蛋白酶消化，调整细胞密度至1.0×109/L后接种于含10%胎牛血清DMEM培养皿中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，将细胞以1.2×109/L接种于6孔培养板，分为空白对照组(正常间质成纤维细胞)、模型组、含药血清低、中、高剂量组(分别为5%、10%、20%FSJZ方含药血清)，每组设3个复孔，各组细胞继续培养12 h后，加入含药血清(空白对照、模型组加入20%体积的对照血清)作用48 h后，进行相关指标检测。

2.3 Real-time -PCR检测mRNA水平 Trizol法提取总RNA，按照试剂盒说明书进行cDNA第1链的合成。以反转录产物为模板，引物序列见表1，进行real-time PCR反应。反应体系为20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，逆转录产物1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反应条件为95 ℃15 min；95 ℃10 s、50～60 ℃30 s循环40次。反应结束后自动生成熔解曲线，结果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法对目的基因进行相对定量分析[7-9]。

表1 基因引物序列

2.4 Western blotting法检测蛋白水平 蛋白变性后在10% SDS-PAGE中分离，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入Ⅰ抗4 ℃摇床振荡孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min，加入Ⅱ抗，室温摇床振荡孵育2 h，ECL化学发光法显影，Gel-Pro 3.2软件对结果进行灰度分析。

3 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异比较采用单因素方差分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 扶肾降浊方含药血清对肾间质成纤维细胞HGF、BMP-7 mRNA表达的影响

MsPGN大鼠肾小管间质损害后体外培养间质成纤维细胞，模型组与对照组比较，HGF和BMP-7的 mRNA表达下调(P<0.05)。随着造模时间的延长，10%含药血清组在第20周，20%含药血清组在第12、16和20周成纤维细胞HGF mRNA的表达明显上调(P<0.05)；5%含药血清组在第20周，10%、20%含药血清组在第12、16和20周成纤维细胞BMP-7 mRNA表达明显上调(P<0.05)。见表2、3。

表2 扶肾降浊方对肾间质成纤维细胞HGF mRNA表达的影响

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

表3 扶肾降浊方对肾间质成纤维细胞BMP-7 mRNA表达的影响

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

2 扶肾降浊方含药血清对肾间质成纤维细胞HGF、BMP-7蛋白表达的影响

MsPGN大鼠肾小管间质损害后体外培养间质成纤维细胞，模型组与对照组比较，HGF、BMP-7蛋白表达明显下调(P<0.05)。5%、10%、20%扶肾降浊方含药血清组在第12、16、20周成纤维细胞HGF、BMP-7的蛋白表达明显上调(P<0.05)。见图1～3。

讨 论

HGF和BMP-7是重要的肾营养因子，负性调节肾纤维化[10]。HGF是一种对多种器官具有多效性的多肽细胞因子，在动物模型中能明显抑制患病肾脏系膜细胞及成纤维细胞的活化。其拮抗TGF-β1介导成纤维细胞激活，阻断小管细胞转化而阻止肾脏纤维化作用，因此，HGF水平下降会加重肾纤维化程度。BMP-7是另一种重要的肾营养因子，广泛表达于各种肾脏细胞且对肾脏的发育起着决定性作用[11]。在肾脏发育过程中，BMP-7缺乏导致肾间充质细胞死亡，BMP-7缺乏的小鼠在围产期死于尿毒症。BMP-7与受体结合后，可活化Smad 6，使得Smad 6表达增加，Smad 6是TGF-β信号通路的负反馈调节分子，能抑制Smad 2和Smad 3的磷酸化而抑制TGF-β导致纤维化和致肾小管细胞转分化效应，从而达到抗纤维化的作用[12]。

Figure 1.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal interstitial fibroblasts in 12 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

Figure 2.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal interstitial fibroblasts in 16 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

Figure 3.The protein expression of HGF and BMP-7 in renal in terstitial fibroblasts in 20 weeks detected by Western blotting. 1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs model group; △P<0.05 vs control group.

前期研究发现，扶肾降浊方干预肾小管间质损害造成的肾组织TGF-β1/Smads/ILK信号转导通路基因和蛋白表达异常，负性调节肾小管EMT，减少炎细胞的浸润与减轻肾小管间质和肾小球损伤，延缓肾小管间质损害病程的进展[13]。那么，扶肾降浊方在延缓肾小管间质损害病理进程和抗肾纤维化方面是否还有更深、更多的影响和机制？本研究从肾小管间质纤维化的第2阶段(抗纤维化的因子HGF、BMP-7释放，参与肾脏的自身防御，促进炎症消散和组织修复)着手，观察扶肾降浊方含药血清对肾小管间质损害大鼠间质成纤维细胞抗纤维化因子HGF和BMP-7的影响，探讨扶肾降浊方含药血清对MsPGN肾小管间质损害大鼠肾间质成纤维细胞的保护作用及机制。

本研究在MsPGN动物模型的基础上，延长造模时间至20周，使其自然发展为肾小管间质损害模型，第12、16和20周的模型大鼠肾脏经病理组织学观察，证实MsPGN动物模型复制成功。光镜检查第12周模型大鼠肾小管上皮细胞出现肿胀、颗粒变性、坏死，个别小管完全萎缩，Masson染色显示有间质纤维化伴炎细胞浸润。第16周、20周模型大鼠小管变性、坏死程度进一步加重，Masson染色显示肾小球和肾间质有大量纤维组织增生及大量炎细胞浸润，且病变随着时间延长逐步加重，此部分研究内容另行发表。

本实验研究发现，MsPGN大鼠发展为肾小管间质损害后，体外培养病理状态间质成纤维细胞，抗纤维化因子HGF、BMP-7mRNA和蛋白表达水平均明显下降，随着造模时间的延长，扶肾降浊方含药血清能部分逆转肾小管损害造成的上述mRNA和蛋白表达的异常，提示扶肾降浊方含药血清可通过升高抗纤维化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白的表达，可能是其发挥保护肾小管间质作用的机制，本研究为中医药防治慢性肾功能衰竭提供了新的思路。

[1] 刘春莹，陈磊鑫，冷 伟. 复方肾复片对MsPGN大鼠肾小管间质损害的影响[J]. 现代中医药, 2013, 33(3):89-92.

[2] Veisa G, Birlescu CA, Siriopol D. The importance of renal biopsy in the management of renal transplantation[J]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 2014, 118(2):376-380.

[3] 李国霞，黄文政，何永生. 扶肾降浊法治疗慢性肾功能衰竭80例临床观察[J]. 山东中医杂志, 2005, 24(4):207-209.

[4] 李国霞，黄文政，何永生. 扶肾降浊法对肾功能衰竭大鼠常规指标的影响[J].天津中医药, 2005, 22(2):108-110.

[5] 刘 震，周树录，谭建三. 大鼠系膜增生性肾小球肾炎模型的改进[J]. 华西医科大学学报, 1996, 27(2):182-184.

[6] 李国霞，黄文政，朱小棣. 系膜增生性肾小球肾炎肾小管间质损害模型的建立及肾疏宁的保护作用[J]. 天津中医药, 2007, 24(4):325-327.

[7] 张晨月，张 舒，吴 莹，等. 犀角地黄汤合银翘散对流感病毒感染的小鼠肺组织及大鼠肺微血管内皮细胞ICAM-1和VCAM-1表达的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(9):1685-1690.

[8] 宋 囡，何文智，王智民，等. 左、右归丸及其拆方对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(7):1268-1274.

[9] 高巧艳，李明才，李燕子，等. IL-33/ST2信号通路在纤维化疾病中的作用[J].中国病理生理杂志, 2013, 29(9):1712-1717.

[10]Stewart N, Chade AR. Renoprotective effects of hepatocyte growth factor in the stenotic kidney[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2013, 304(6):F625-F633.

[11]Meng XM, Chung ACK, Lan HY. Role of the TGF-beta/BMP-7/Smad pathways in renal diseases[J]. Clin Sci, 2013, 124(4):243-254.

[12]Wong MG, Perkovic V, Woodward M, et al. Circulating bone morphogenetic protein-7 and transforming growth factor-β1 are better predictors of renal end points in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. Kidney Inte, 2013, 83(2): 278-284.

[13]杨奇茹，李国霞，李宝丽，等. 扶肾降浊方剂对肾小球系膜增生性肾炎大鼠肾组织TGF-β1及CTGF表达的影响[J]. 山东医药, 2014, 54(3):33-35.

促纤维化蛋白WNT5A在脓毒症诱导的急性肺损伤的早期被激活

急性呼吸窘迫综合征中肺损伤和纤维化的机制鲜为人知。WNT/β-连环蛋白信号通路的功能在肺修复和纤维化中日益受到重视，为了证实这条通路在脓毒症之后早期在肺组织中被激活。一组西班牙科学家在体外肺细胞损伤模型中将人支气管上皮细胞(BEAS-2B)和人胚肺成纤维细胞(MRC-5)暴露在内毒素中18 h，用盲肠末端结扎穿孔术诱发动物脓毒性急性呼吸窘迫综合征，并从因患败血症性急性呼吸窘迫综合征而死亡的病人身上提取死亡24 h的肺组织，通过免疫印迹和免疫组织化学的方法检测涉及 Wnt 通路的WNT5A、非磷酸化(Ser33/37/Thr41)β-连环蛋白、基质金属蛋白酶7(MMP7)、细胞周期蛋白D1和血管内皮生长因子。他们发现这些蛋白质就是WNT/β-连环蛋白信号通路的主要靶点。WNT5A、非磷酸化(Ser33/37/Thr41)β-连环蛋白、总β-连环蛋白、MMP7、细胞周期蛋白D1蛋白和血管内皮生长因子在经内毒素刺激的BEAS-2B和MRC-5细胞中均增加。从脓毒血症动物和脓毒血症患者的肺组织中可以发现急性肺部炎症，胶原蛋白沉积，WNT5A和MMP7蛋白水平明显增加。因此，在脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征中WNT/β-连环蛋白信号通路会在早期被激活，并且能够在肺的修复和纤维化中起重要的作用。对这条通路的调整可能是治疗脓毒血症和急性呼吸窘迫综合征的潜在靶点。

Crit Care, 2014, 18(5):568(唐翔诩)

Effect of drug-containing serum of Fushen Jiangzhuo formula on anti-fibrosis factors HGF and BMP-7 in rat renal interstitial fibroblasts with renal tubulointerstitial lesion

LI Chun-yu, WEI Xiao-lu, SU Wei-lian, LI Guo-xia

(InternationalMedicalSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China.E-mail:liguoxia96@163.com)

AIM: To study the protective effects and mechanism of Fushen Jiangzhuo formula (FSJZ) on the rat renal interstitial fibroblasts with renal tubulointerstitial lesion. METHODS: The serum containing FSJZ and blank control serum were prepared. The rat model of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN) was established and extended the time of modeling to 20th weeks for developing tubulointerstitial lesion naturally. The rat renal interstitial fibroblasts at the end of 12, 16, 20 week of modeling were isolated and cultured. The effects of FSJZ on the expression of hepatocyte growth factor (HGF) and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) at mRNA and protein levels in the pathological renal interstitial fibroblasts were determined. RESULTS: The anti-fibrosis factors HGF and BMP-7 were changed in pathological renal interstitial fibroblasts. Renal tubulointerstitial lesion significantly down-regulated the expression of HGF and BMP-7, while the drug containing serum of FSJZ significantly up-regulated the expression of HGF and BMP-7. CONCLUSION: Drug containing serum of FSJZ has protective effect on pathological renal interstitial fibroblasts by regulating the mRNA and protein expression of HGF and BMP-7.

Fushen Jiangzhuo formula; Renal interstitial fibroblasts; Serologic pharmacological test; Hepatocyte growth factor; Bone morphogenetic protein-7

1000- 4718(2015)01- 0076- 05

2014- 08- 08

2014- 09- 30

天津市自然科学基金资助项目(No. 11JCYBJC12800)

△通讯作者 Tel: 022-83336911； E-mail: liguoxia96@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.015