儿童多重耐药肠球菌感染流行病学及耐药基因筛选

张书婉，黄君华

(1.西安市儿童医院检验科，陕西 西安 710003；2.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021)

儿童多重耐药肠球菌感染流行病学及耐药基因筛选

张书婉1，黄君华2

(1.西安市儿童医院检验科，陕西 西安 710003；2.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021)

目的 了解儿童感染肠球菌的临床分布、耐药表型和耐药基因的携带情况，为临床合理用药、控制院内感染及流行病学调查提供依据。方法收集西安市儿童医院2014年2月至2015年1月分离的肠球菌180株，用K-B法检测12种抗菌药物的耐药情况，运用多重PCR检测aac(6')-Ie-aph9(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id、erm(B)、mef(A)、tet(M)、tet(L)等耐药基因。结果在180株临床分离株中屎肠球菌118株，粪肠球菌46株，其他肠球菌16株；其中分离自尿液的最多，占34.4%。药敏结果显示屎肠球菌对红霉素和四环素的耐药率分别为84.7%和67.8%，高浓度庆大霉素耐药(HLGR)菌株占83.0%；粪肠球菌对红霉素和四环素的耐药率为82.6%和82.6%，HLGR菌株占73.9%；未发现利奈唑胺和万古霉素耐药菌株。140株HLGR肠球菌中aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia检出率为92.8%，aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id均为阴性。150株红霉素耐药菌株中erm(B)基因的检出率为66.6%，未检测到mef(A)基因。126株四环素耐药菌株中，tet(M)和tet(L)的检出率分别为98.4%和80.9%。结论儿童肠球菌感染主要由屎肠球菌和粪肠球菌引起，且以尿路感染最为常见；多重耐药情况严重，耐药性由多基因支配，HLGR为医院感染的重要耐药菌，主要通过aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因介导；红霉素的耐药性主要通过erm(B)基因介导；四环素的耐药基因以tet(M)和tet(L)多见。

儿童；肠球菌；流行病学；多重耐药；耐药基因

近年来随着广谱抗菌药物的不合理使用，介入性诊疗手段和免疫抑制剂的大量应用，肠球菌所导致的感染不断增加，已成为儿童医院感染的主要病原菌[1]，多重耐药肠球菌的耐药问题也越来越引起人们的关注[2]。因此，针对肠球菌的流行病学分析和耐药监测显得至关重要。本研究收集西安市儿童医院住院患儿180份肠球菌菌株，对儿童肠球菌感染流行情况、药敏结果和耐药基因进行分析，旨在为儿童肠球菌的预防及临床合理使用抗生素提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 西安市儿童医院2014年2月至2015年1月住院患儿送检标本，经VITEK compact全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定为肠球菌，共180株。

1.2 试剂 Mueller-Hinton琼脂、Mueller-Hinton肉汤购自上海中科昆虫生物技术有限公司。肠球菌琼脂、肠球菌肉汤购自青岛海博生物技术有限公司。庆大霉素、呋喃妥因、奎奴普丁/达福普汀、四环素、红霉素、万古霉素、氨苄西林/舒巴坦、左氧氟沙星、氯霉素、利奈唑胺、青霉素、氨苄西林购自英国Oxoid公司。

1.3 药敏实验 按照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的K-B药敏纸片扩散法进行药敏实验，判读标准以临床和实验室标准化研究所(CLSI)2010年制定的规程进行。质控菌株粪肠球菌ATCC 29212和金黄色葡萄球菌ATCC 25923与检测菌株平行进行药敏测定。

1.4 肠球菌DNA的提取及耐药基因的检测 应用Bacterial DNA Extraction Mini Kit法(TIANGEN，China)，具体操作步骤见试剂盒说明书。aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id基因引物参照文献[3]，erm(B)、mef(A)、tet(L)、tet(M)基因引物分别参照文献[4-6]，由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系和条件：10×buffer 2.5µl，10 mmol/L dNTP 0.25µl，25 mmol/L MgCl22.5µl，3.3µmol/L引物各0.5µl，Taq酶(5 U/µl)0.125µl，DNA模板1µl，ddH2O 17.625µl。PCR热循环参数：aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id基因：94℃预变性10 min，然后94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循环35周期，最后72℃延长至5 min。erm(B)、tet(L)、tet(M)基因：95℃预变性5 min，然后93℃1 min，52℃1min，72℃1 min，循环30周期，最后72℃延长至5 min。mef(A)基因：95℃预变性5 min，然后95℃40 s，52℃40 s，72℃1 min，循环30个周期，最后72℃延长至5 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。随机挑取部分PCR扩增产物送上海生工生物技术有限公司进行序列测定，将测序结果与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)核酸数据库进行比对。

2 结果

2.1 肠球菌分布特征 临床标本中共分离肠球菌180株，其中屎肠球菌118株(占65.6%)，粪肠球菌46株(占25.6%)，其他肠球菌16株(占8.9%)，包括鹑鸡肠球菌8株，铅黄肠球菌6株和棉子糖肠球菌2株。180株肠球菌分布于不同科室，见表1。180株样本在各种标本中所占的比例也不同，其中尿液中检出最多，其次为引流液，其他种类较少，见表2。

表1 180株肠球菌临床分离株的科室分布(株)

表2 180株肠球菌在临床标本中的分布[株(%)]

2.2 药敏试验结果 对180株肠球菌进行药敏试验，观察其对12种常用抗菌药物的耐药情况，结果见表3。

表3 肠球菌分离株对12种抗生素的药敏率(%)

2.3 肠球菌的多重耐药性 180株肠球菌中对10种抗菌药物耐药的为2例屎肠球菌，占1.1%；对9种抗菌药物菌耐药的为10例屎肠球菌，占5.6%；对7种抗菌药物同时耐药的菌株所占比例最高，为36.7%(66/180)；其次为耐6种和5种抗菌药物的菌株，所占比例分别为13.3%(24/180)和11.1%(20/ 180)，见表4。

2.4 耐药基因检测结果 118株屎肠球菌阳性耐药基因检测结果为：在98株庆大霉素高水平耐药菌株中，aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的检出率为95.9%，未检测到aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因；20株庆大霉素敏感屎肠球菌中6株也检测到了aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因，检出率为30.0%。150株对红霉素耐药的屎肠球菌中，erm(B)基因的检出率为66.6%，未检测到mef(A)基因。126株对四环素耐药的屎肠球菌中，tet(M)和tet(L)基因的检出率分别为98.4%和80.9%。34株庆大霉素高水平耐药菌株中，aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的检出率为88.2%，未检测到aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因。38株对红霉素耐药的粪肠球菌中，erm(B)基因的检出率为94.7%，未检测到mef(A)基因。38株对四环素耐药的粪肠球菌中，tet(M)和tet(L)基因的检出率分别为100.0%和52.6%，见表5。16株除屎肠球菌和粪肠球菌以外的肠球菌耐药基因的检测结果，见表6。

表4 肠球菌的耐药种数和构成比(%)

表5 屎肠球菌耐药菌株和敏感菌株耐药基因检出率以及粪肠球菌耐药基因检出率

表6 16株其他肠球菌耐药菌株和敏感菌株耐药基因检出率

3 讨论

本研究共收集180株肠球菌，来自多个临床科室，可见肠球菌广泛分布于医院环境内。同时，屎肠球菌和粪肠球菌存在于多种不同性质的标本来源中，包括尿液、引流液、肺泡灌洗液、血液、胆汁、腹水、脑脊液等，也进一步证明肠球菌可以在人体不同环境内存在，一定条件下可以导致机体各个部位的感染。180株肠球菌中分离自尿液的最多，占34.4%(62/180)；其次分离于引流液，占25.6%(46/180)；肺泡灌洗液和血液来源的均居第三位，占6.7%(12/180)；腹水来源居第五位，占5.6%(10/180)。由此可推断，在肠球菌所致的感染中以尿道感染最常见，这与欧阳彬[7]的报道较一致。在所分离的肠球菌中屎肠球菌和粪肠球菌的分离率最高，分别为65.6%(118/180)和25.6%(46/180)，共占总数的91.2%(164/180)，且屎肠球菌的分离率明显高于粪肠球菌，而成人医院则以粪肠球菌为主[7-8]。

本研究发现，在检测的12种抗菌药物中，屎肠球菌和粪肠球菌的耐药谱和耐药率不同。118株屎肠球菌对青霉素、氨苄西林、红霉素、氨苄西林/舒巴坦、高水平庆大霉素和左氧氟沙星的耐药率均高于80%；46株粪肠球菌则对四环素、红霉素和奎奴普丁/达福普汀的耐药率处于高水平，均高于80%。粪肠球菌对奎奴普丁/达福普汀的耐药率达87.0%，而屎肠球菌对其的耐药率仅为10.2%；屎肠球菌对β-内酰胺类抗生素(青霉素、氨苄西林)的耐药率明显高于粪肠球菌；未发现对利奈唑胺和万古霉素耐药菌株。整体分析，两种细菌对红霉素和高水平庆大霉素的耐药率均高于60%，与李爽等[9]的报道一致，可能与这两种抗生素作为临床常用药在临床的长期应用密切相关。在这180株样本中，对7种抗生素同时耐药的菌株占总数的36.7%(66/180)，其次为同时耐受6种和5种抗生素的菌株，所占比例分别为13.3%(24/180)和11.1%(20/180)。总体分析180株样本，对4种及以上抗生素同时耐药的菌株高达84.5%(152/180)，提示应加强措施控制多重耐药肠球菌的蔓延。

近年来关于肠球菌耐药基因的检测或耐药基因作用机制的研究较多，不同来源，不同种属的肠球菌在耐药基因的检出率上存在较大的差异，这可能与地区、人群或标本等的构成不同有关。本研究得到耐高浓度庆大霉素(HLGR)菌株140株，在这些菌株中aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的检出率为92.8%。而在180株肠球菌中均未检出aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因，提示aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的存在是导致HLGR发生的主要原因，这与其他国内研究结果相一致[10]。有10株HLGR未能检测到以上四种氨基糖苷类耐药基因，提示其耐药机制可能由其他耐药基因介导。150株对红霉素耐药肠球菌中，erm(B)基因的检出率为66.6%，未检测到mefA基因，提示肠球菌对红霉素的耐药性可能主要由erm(B)基因介导，且粪肠球菌中erm(B)的检出率(94.7%)明显高于屎肠球菌(60.0%)。126株四环素耐药肠球菌中，tet(M)基因阳性率为98.4%，tet(L)基因阳性率为80.9%；在38株耐四环素的粪肠球菌中，tet(M)基因的检出率为100.0%，可见四环素药敏表型与tet(M)基因型在粪肠球菌中有很高的符合率，而tet(L)基因的检出率仅为52.63%(20/38)；在80株耐四环素的屎肠球菌中，tet(M)基因型与tet(L)基因型与四环素药敏表型的符合率分别为97.5%(78/80)和92.5%(74/80)，同样处于较高水平。值得提及的是，在28株对高水平庆大霉素敏感的肠球菌中，有8株检测出携带有aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因；同样，在38株对四环素敏感的屎肠球菌中，分别由4株和6株携带有tet(M)基因和tet(L)基因。这种表型与基因型不一致可能为基因突变或基因的表达受抑制所致，其内在机制需进一步讨论研究。

综上所述，肠球菌是儿童院内感染的常见病原菌，以屎肠球菌为主，且主要为尿路感染。肠球菌多重耐药情况严重，同一菌株携带多种耐药基因的频率较高，警示我们要合理使用抗菌药物，减少细菌耐药。

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Clinical epidemiology and antibiotic resistant genes of multidrug-resistant Enterococcus isolated from infected children.

ZHANG Shu-wan1,HUANG Jun-hua2.1.Department of Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi’an 710003,Shaanxi,CHINA;2.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi, CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical epidemiological trend and antibiotic resistant pattern of Enterococci isolated from infected children in order to guide the rational use of antibiotics and effective surveillance of nosocomial infections.MethodsOne hundred and eighty strains of Enterococci isolated from infected children in Xi'an Children's Hospital from February 2014 to January 2015 were collected and analyzed for epidemiological distribution and antibiotic susceptibility profile by K-B Method.Multiplex polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the resistance genes for gentamycin[aac(6')-Ie-aph9(2'')-Ia,aph(2'')-Ib,aph(2'')-Ic,aph(2'')-Id],erythromycin[erm (B),mef(A)],tetracycline[tet(M),tet(L)].ResultsAmong the 180 isolates,which were mainly from urine(34.4%), there were 118 strains ofEnterococcus faecium,46 strains ofE.faecalisand 16 strains ofEnterococci spp(8.9%).Antibiotic susceptibility of Enterococci against 12 antibiotics was determined by K-B method.High-level gentamycin resistance(HLGR)was present in 83.0%ofE.faeciumand 73.9%ofE.faecalisisolates.Resistance to erythromycin and tetracycline was highly prevalent inE.faecium(84.7%and 67.8%,respectively)andE.faecalis(82.7%and 82.6%,respectively).Among the 140 HLGR isolates,the most prevalent resistant determinant was aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia (92.9%),while none of the isolates harboredaph(2'')-Ib,aph(2'')-Ic oraph(2'')-Id.The erm(B)gene was responsible for erythromycin resistance in 66.6%of the erythromycin resistant enterococcal isolates,while other erythromycin resistant genes were not detected.Thetet(M)andtet(L)genes were successfully amplified from 98.4%and 80.9%of tetracycline resistant isolates,respectively.There was no linezolid and vancomycin resistance.ConclusionEnterococci are important nosocomial pathogens withE.faeciumandE.faecalisspecies most commonly isolated from clinical specimens in children.Urinary tract infection is the most common infection of Enterococcus for children.HLGR has become the important antibiotic resistance bacteria,which results in nosocomial infection,and theaac(6')-Ie-aph(2")-Ia gene is the main aminoglycoside-modifying enzyme gene which causes HLGR.erm(B)is the most prevalent genotype in the erythromycin resistant isolates,while harbouringtet(M)andtet(L)is the cause of tetracycline resistance.

Children;Enterococcus;Epidemiology;Multidrug resistance;Resistance genes

R725.7

A

1003—6350（2015）17—2554—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0925

2015-03-01)

张书婉。E-mail：shuwan0103@163.com