IL-18、TNF-α、CRP在甘油致大鼠急性肾损伤中的变化及意义

杨浩强，黄向阳，孟晓燕，张 敏，谭鹤长

(柳州市工人医院肾内科，广西 柳州 545005)

IL-18、TNF-α、CRP在甘油致大鼠急性肾损伤中的变化及意义

杨浩强，黄向阳，孟晓燕，张 敏，谭鹤长

(柳州市工人医院肾内科，广西 柳州 545005)

目的 通过检测白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)在甘油致大鼠急性肾损伤中各个时间点的变化，探讨炎症反应是否参与了大鼠甘油急性肾损伤发病过程。方法40只大鼠被随机分为实验组(GL组，n=32)和对照组(NS组，n=8)，其中GL组按注药后各个时间点不同将GL组依次分为GL 24 h组、GL 48 h组、GL 72 h组、GL 96 h组，各小组8只，分别检测注药后各个时间点大鼠血肌酐(Scr)、IL-18、TNF-α、CRP等相关生化指标，并进行统计学相关分析，同时观察各个时间点大鼠肾脏病理变化。结果实验组各个时间点Scr、IL-18、TNF-α、CRP等生化指标均较对照组明显升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；肾脏病理提示肾小管较对照组明显变性。结论在甘油致大鼠急性肾损伤中，炎症因子IL-18、TNF-α、CRP明显升高，提示炎症反应参与了大鼠甘油急性肾损伤发病过程，且肾小管为大鼠甘油急性肾损伤主要靶位。

甘油；急性肾损伤；炎症因子

急性肾损伤(AKI)是高发病率和高死亡率疾病，其发病机制目前尚未完全清楚，而且不同方法、不同动物建立的AKI伤模型各有特点，因此建立动物模型对全面深入地研究AKI发病机制和寻找高效的治疗途径以及特效药物有着十分重要的意义。目前有研究表明炎症反应参与AKI发病过程，而在甘油急性肾损伤中尚未见有相关报道。本研究通过甘油肌肉注射法创建大鼠AKI动物模型，探讨炎症反应是否参与大鼠甘油急性肾损伤发病过程，从而为临床提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 购自广西医科大学试验动物中心健康成年雄性SD大鼠40只，体重200～220 g，SPF级。

1.2 饲养条件 大鼠饲养于动物试验中心，动物中心温度设置在20℃～28℃，空气湿度控制在50%～60%，采用明亮、黑暗各12 h交替的照明措施，大鼠分笼喂养，24 h内自由饮水进食。

1.3 试验主要药品、试剂 50%甘油溶液(武汉大华伟业医药化工有限公司)，大鼠IL-18 ELISA试剂盒(上海科华生物工程有限公司)，大鼠TNF-αELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 大鼠甘油急性肾损伤采用的诊断标准 诊断标准采用AKIN共识标准中的48 h内Scr较基线升高＞50%[1]，排除梗阻性肾病或脱水状态。

1.5 操作方法

1.5.1 分组方法 40只大鼠被随机分为实验组(GL组，n=32)和对照组(NS组，n=8)，其中GL组按注药后时间不同依次分为GL 24 h组、GL 48 h组、GL 72 h组、GL 96 h组，每组各8只；SD大鼠适应性喂养3 d后，按随机数字法平均分为5组，随机分配到GL组和NS组中。

1.5.2 实验步骤 GL组大鼠采用50%甘油盐水10 mg/kg单次双后肢肌肉注射创建大鼠AKI模型，NS组采用10 ml/kg生理盐水单次双后肢肌肉注射，然后取各时间点大鼠，吸入乙醚麻醉后腹正中切开，门静脉采血行Scr、IL-18、TNF-α、CRP测定，摘除双肾行HE病理切片。

1.5.3 检测方法 IL-18、TNF-α采用ELISA法，实验步骤严格按照试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm测定吸光值，计算其回归方程，最终推算其相应的浓度；Scr、CRP采用全自动生化检测仪测定；肾脏经过甲醛固定、梯度乙醇脱水、包埋、切片、二甲苯固定、染色等层序制作大鼠肾脏HE病理切片。

1.6 观察指标：(1)大鼠一般情况；(2)血生化指标变化：Scr、IL-18、TNF-α、CRP等生化指标变化；(3)肾脏病理变化。

1.7 统计学方法 所有计量资料采用均数±标准差(x-±s)表示，应用SPSS17.0统计软件进行分析；成组设计的多样本比较采用区组设计方差分析，组内多个均数间两两比较采用LSD检验，设检验水准为α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 注药后两组大鼠体重无明显变化，均无死亡，但GL组大鼠出现精神萎靡、毛色稀疏发黄无光泽、闭眼懒动、进食尿量减少等现象，且上述现象随时间加重。

2.2 血生化指标变化 各组大鼠Scr、IL-18、TNF-α、CRP测定结果见表1。与NS组比较，GL组Scr 24 h时未见明显升高(P＞0.05)，48 h时明显高于NS组，差异有统计学意义(P＜0.05)，72 h明显较基线升高＞50%，24～96 h内呈持续性升高趋势；与NS组比较，GL组IL-18在24 h时升高不明显(P＞0.05)，48 h时明显上升，差异有统计学意义(P＜0.05)，之后开始下降，至96 h时仍处于较高水平；与NS组比较，GL组TNF-α在24 h时明显升高，明显高于NS组，差异有统计学意义(P＜0.05)，48 h时达到峰值，至96 h时仍有较高水平；与NS组比较，GL组CRP在24 h时明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，72 h时达到峰值，至96 h时仍有较高水平。

表1 各组大鼠Scr、IL-18、TNF-α、CRP测定结果(n=8，±s)

表1 各组大鼠Scr、IL-18、TNF-α、CRP测定结果(n=8，±s)

注：GL组与NS比较，aP＜0.05，GL组内各组间比较，bP＜0.05。

组别Scr(µmol/L)IL-18(ng/L)TNF-α(pg/ml)CRP(ng/ml)NS组GL 24 h组GL 48 h组GL 72 h组GL 96 h组F值P值46.8±5.4 47.3±5.2 58.9±7.1ab87.4±11.3ab108.6±12.5ab48.3 0.00 18.5±4.4 19.3±4.5 42.6±9.5ab40.4±9.1a36.3±8.7a27.4 0.00 35.7±5.4 61.8±8.3ab 158.9±21.3ab135.8±13.8ab121.6±12.3ab19.3 0.00 3.4±0.8 4.4±1.1ab6.6±1.4ab9.7±1.8ab8.3±1.6ab45.6 0.00

2.3 肾脏病理变化 同NS组比较，除GL组肾小球有淤积的红细胞外，两组肾小球未见明显异常，但GL组肾小管明显变性，可见肾小管上皮细胞刷状缘脱落、胞质空泡变性、管腔扩张、肾小管管型、炎症细胞浸润，且肾小管变性随时间加重(见图1)。

图1 各个时间点大鼠肾脏HE病理HE染色结果

3 讨论

随着近年来医药工业的迅猛发展，新药不断在临床上应用，药物诱导AKI呈逐年增长的趋势，已成为临床医药工业不可回避的问题。依据AKI诊断标准已有报道称药物导致AKI发病率占AKI总发病率的8%～60%，而在危重病患者，AKI死亡率高达60.3%[2-3]，表明AKI是高发病率和高死亡率疾病。目前AKI发病机制尚未完全清楚，在药物导致AKI总发病机制中已有药物直接毒性作用、氧化应激、细胞凋亡坏死、一氧化氮等机制，但随着近年来基础研究进一步深入，炎症反应在AKI作用机制逐渐受到人们的重视。炎症反应是炎症物质引起的血管内发炎，轻微的炎症反应无全身或局部的临床感染征象，但是存在低水平、持续的炎症状态，表现为炎症因子升高，目前在甘油导致AKI中尚未有炎症反应相关报道。

甘油为渗透压高达7 692 mOsm的高渗性物质，甘油肌注后即可引起局部肌肉变性坏死以及局部红细胞溶解，由于肌红蛋白和血红蛋白分子量较小，能自由通过肾小球而进入肾小管，而肾小管不能吸收而形成管型堵塞肾小管，引起肾小管和间质损伤；此外，肌红蛋白和血红蛋白都可分解为高铁血红素，对肾小管直接产生毒性作用；因此甘油AKI模型与临床严重组织创伤所致AKI极为相似，对挤压型AKI研究有着重要意义，因此建立动物模型对全面深入地研究急性肾损伤发病机制和寻找高效的治疗途径以及特效药物有着十分重要的意义。本研究Scr变化表明，在24～72 h内Scr较基线升高＞50%，且无大鼠死亡，表明10 mg/kg 50%甘油双后肢肌肉注射创建大鼠甘油AKI模型成立。

在AKI中肾小管上皮细胞损伤会引发损伤关联分子模式的释放，此物质可激活Toll样受体[4]，Toll样受体激活转录因子-κB(NF-κB)，产生大量的趋化因子和细胞因子，这些趋化因子及细胞因子上调粘附分子和吸引炎症细胞，如中性粒细胞和T细胞，造成肾脏本区域的损伤；另一方面目前研究较多的氧化损伤介导的氧化应激损伤可加重炎症反应，研究表明氧自由基介导的细胞毒性和脂质过氧化损伤可以通过放大炎症反应、变态反应和直接毒性作用导致全身或局部组织损伤[5-6]。

IL-18是主要由单核巨噬细胞及肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小囊脏层上皮细胞等肾实质细胞产生的促炎症细胞因子，属于IL-1家族成员，在AKI中可诱导近端肾小管表达，并裂解释放进入尿液中，IL-18可以诱导T细胞产生IFN-γ，还可以促进其他细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-8及一氧化氮等的生成[7]。本研究结果表明，在GL实验组中，IL-18在48 h明显升高且明显高于NS对照组，提示在甘油致大鼠急性肾损伤中IL-18表达上调；与儿童心脏术后AKI研究结果IL-18在术后6 h时明显升高，并于术后12 h左右达到高峰，2 d后仍较基线明显升高的已发表研究相符合[8-9]。

TNF-α是一种具有多种生物功能的多肽，在许多传染病和炎症性疾病中起着核心作用，TNF-α在肾脏疾病损害中的作用机制包括促进内皮细胞的损伤、加重肾脏缺血、促进肾小球内微血栓的形成等；TNF-α在AKI中产生是高度依赖于活性氧、NF-κB活化和活化p38蛋白。本研究结果表明，在GL组中24 h明显较NS组升高(P＜0.05)，48 h达到峰值，至96 h仍有较高水平，提示在甘油急性肾损伤中TNF-α明显升高。本实验研究结果与Ramesh研究顺铂致肾损伤中TNF-α介导趋化因子、细胞因子表达及Kuhad等研究姜黄素对顺铂肾毒性的炎症和氧化应实验效果中血清TNF-α水平的变化结果相符合[10-11]。

CRP是由肝脏在各种刺激下合成并分泌的一种非特异性急性时相中间产物，是人体非特异性免疫的一部分，CRP在正常情况下呈低表达状态，但在组织损伤、坏死时明显分泌增多。本研究结果表明，GL组CRP在24 h明显升高，72 h达到峰值，至96 h仍有较高水平，表明在甘油致大鼠急性肾损伤过程中CRP有异常升高。

大量的临床研究及基础研究表明：甘油急性肾损伤肾脏病变主要为肾小管上皮细胞功能障碍。本实验肾脏病理HE染色结果提示：GL组与NS组比较，除GL组肾小球有红细胞淤积外，两组肾小球未见明显异常；NS组肾小管未见明显异常，但GL组大鼠肾小管明显变性，且肾小管病变随时间而逐渐加重，即本研究结果证实了甘油肾毒性作用靶点主要针对肾小管而不是肾小球。本研究结果与廖长秀等[12]在阿魏酸钠对甘油致小鼠肾脏氧化性损伤的拮抗效应中研究结果(甘油急性肾损伤时肾脏病变主要在肾小管)是相符合的。

综上所述，在甘油致大鼠急性肾损伤中，炎症因子IL-18、TNF-α、CRP明显升高，表明炎症状态参与了大鼠甘油急性肾损伤发病过程；同时肾脏病理表明肾小管为大鼠甘油急性肾损伤主要靶位。

[1]Mehta RL,Kellum JA,Shah SV,et a1.Acute kidney injury network: report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury [J].Crit Care,2007,11(2):R31.

[2]Bellomo R,Kellum JA,Ronco C.Acute kidney injury[J].Lancet, 2012,380(9843):756-766.

[3]Bengatta S,Armould C,Letavernier E,et al.MMP9 and SCF protect from apoptosis in acute kidney injury[J].J Am Soc Nephrol, 2009,20(4):87-89.

[4]Miller RP,Tadagavadi RK,Ramesh G,et al.Mechanisms of Cisplatin nephrotoxicity[J].Toxins(Basel),2010,2(11):2490-2518.

[5]李 冰,潘志铣,刘素雁,等.甘油致BALB/C小鼠急性肾损伤后肾脏观察[J].国际免疫学杂志,2011,34(4):318-322.

[6]夏晓红,申玉学,石纪才,等.拮抗内皮素生物学效应对甘油所致大鼠急性肾功能衰竭的影响[J].中国病理生理杂志,2009,15(4): 123-128.

[7]张 璇,张玉萍.IL-18的研究进展[J].实用癌症杂志,2012,27 (5):533-555.

[8]Parikh CR,Mishra J,Thiessen-Philbrook H,et al.Urinary IL-18 is an early predictive biomarker of acute kidney injury after cardiac surgery[J].Kidney Int,2006,70(1):199-203.

[9]Parikh CR,Mishra J,Thiessen-Philbrook H,et al.Urinary IL-18 is an early predictive biomarker of acute kidney injury after cardiac surgery[J].Kidney Int,2011,70(1):199-203.

[10]Lee H,Nho D,Chung HS,et al.CD4+CD25+regulatory T cells attenuate cisplatin-induced nephrotoxicity in mice[J].Kidney Int,2010, 78(11):1100-1109.

[11]Zhang B,Ramesh G,Norbury CC,et al.Cisplatin-induced nephrotoxicity is mediated by tumor necrosis factor-alpha produced by renal parenchymal cells[J].Kidney Int,2011,72(1):37-44.

[12]廖长秀,汪 晖,彭仁琇,等.阿魏酸钠对甘油致小鼠肾脏氧化性损伤的拮抗效应[J].药学学报,2010,38(12):900-903.

Changes and significance of IL-18,TNF-α and CRP in glycerol-induced acute kidney injury in rats.

YANG Hao-qiang,HUANG Xiang-yang,MENG Xiao-yan,ZHANG Min,TAN He-chang.Department of Nephrology,Liuzhou Worker's Hospital,Liuzhou 545005,Guangxi,CHINA

ObjectiveBy detecting changes of interleukin-18(IL-18),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and C-reactive protein(CRP)in rat models with glycerol-induced acute kidney injury,to discuss whether inflammatory reaction is involved in this pathogenesis.MethodsForty male SD rats were selected and divided into glycerol experimental group(GL group,n=32)and the normal saline control group(NS group，n=8)randomly.GL group was further divided into 4 groups(24 h group,48 h group,72 h group,96 h group,with 8 rats in each group)based on 4 time points.The serum creatinine(Scr),IL-18,TNF-α,CRP were detected at each time point and analyzed statistically to observe the pathological changes of rat kidney.ResultsCompared to NS group,the levels of Scr,IL-18,TNF-α, CRP were all significantly higher(P＜0.05),and that the renal tubule degeneration was significant.ConclusionIn rats with glycerol-induced acute kidney injury,the levels of IL-18,TNF-α,CRP were all significantly increased,which in-dicates that inflammatory reaction is involved in the pathogenesis.Renal tubule is the main target site of glycerol-induced acute kidney injury.

Glycerol;Acute kidney injury;Inflammatory factor

R-332

A

1003—6350（2015）17—2506—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0909

2015-01-16)

黄向阳。E-mail：930298076@qq.com