BGC-823胃癌细胞凋亡相关蛋白受miR-421调控后的表达分析

浦雄勇，姚永良，孙王伟，蒋一彪，吴建红

(江苏大学附属昆山医院检验科，江苏 昆山 215300)

BGC-823胃癌细胞凋亡相关蛋白受miR-421调控后的表达分析

浦雄勇，姚永良，孙王伟，蒋一彪，吴建红

(江苏大学附属昆山医院检验科，江苏 昆山 215300)

目的 研究miR-421在胃癌BGC-823细胞凋亡过程中的分子机制。方法通过siRNA转染技术将miR-421 mimics与miR-421 inhibitors转染BGC-823胃癌细胞；Western blotting方法分析细胞凋亡相关蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2以及细胞凋亡受体蛋白TNFR-Ⅰ、TNFR-Ⅱ的表达水平。结果miR-421 mimics与miR-421 inhibitors成功转染BGC-823胃癌细胞；caspase-3、Bax蛋白在miR-421 inhibitors转染细胞中表达增强，而Bcl-2、TNFR-Ⅰ与TNFR-Ⅱ则表达降低。结论miR-421在BGC-823胃癌细胞中可能通过调控肿瘤细胞凋亡相关蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的表达及肿瘤细胞表面凋亡受体蛋白TNFR的表达从而影响BGC-823的凋亡。

胃癌；miR-421；转染

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种非编码的小RNA，其碱基长度为20～22 bp，可通过碱基配对方式引导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，最终调控蛋白的表达[1]。MiRNA在多种癌组织中均有一定程度的异常表达，并且这些miRNA直接或间接的影响着肿瘤细胞的增殖与凋亡，以上提示miRNA可能发挥着类似原癌基因或抑癌基因的功能[2]。胃癌是人类常见的一种恶性肿瘤，目前众多研究在胃癌中发现了大量的异常表达的miRNA，表明miRNA在胃癌的发生、发展过程中可能发挥着重要作用。临床研究表明miR-421在不同种类及不同分化类型的胃癌细胞中表达水平均显著升高，并且在胃癌早期即异常表达，提示其可能有助于早期胃癌的诊断。本研究通过miR-421在胃癌细胞BGC-823中的表达，探讨其与细胞凋亡相关蛋白的作用及其对细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 BGC-823细胞系购自上海中科院细胞库；DMEM细胞培养基、小牛血清购自HyClone公司；ImagenFect RNAi转染试剂盒购自无锡纳奥生物医药有限公司；预染蛋白相对分子质量(Mr)marker、Cocktail蛋白酶抑制剂均购自Fermantas公司。Caspase-3、Bax、Bcl-2、TNFR-Ⅰ、TNFR-Ⅱ、GAPDH抗体购自武汉博士德生物科技有限公司。MiR-421 mimics、miR-421 inhibitors及miR-421阴性序列由上海吉玛医药生物技术公司合成。

1.2 细胞培养 BGC-823细胞于10%小牛血清，100 μg/μl青霉素-链霉素双抗的EMEM细胞培养基中，37℃，5%CO2，饱和湿度环境中传代培养，而转染用的细胞培养基不添加青霉素-链霉素双抗。

1.3 细胞转染 BGC-823胃癌细胞于12孔细胞培养板中培养24 h，当细胞密集度达80%后，磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻漂洗BGC-823细胞并加入500 μl OpitMEM培养液于细胞培养板孔中。同时将20 pmol的miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分别加入50 μl OpitMEM中；然后再分别加入含5 μl IR试剂的50 μl OpitMEM，微型振荡器震荡10 s，室温静置20 min，再加入12孔细胞培养板中，培养6 h后更换细胞培养基，继续培养24 h。免疫荧光倒置显微镜下观察miRNA的转染效果。

1.4 Western blotting 收集各组经miR-421 mimics、miR-421 inhibitors、negative miRNA转染后的BGC-823胃癌细胞，PBS洗涤2次，1 000 r/min，离心5 min弃上清，加入100 μl预冷的RIPA细胞裂解液，冰上放置40 min。4℃ 12 000 r/min离心15 min，Bradford方法测定蛋白浓度。取各处理组变性蛋白50 μl，于10%的SDS-PAGE胶电泳，转膜后以含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育1 h，ECL作用后，X线胶片曝光成像，经Image J软件定量分析。

1.5 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，两组间比较采用t检验，多组间两两比较采用Scheffe法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA转染BGC-823细胞 通过Imagen-Fect RNAi试剂盒将miR-421 mimics、miR-421 inhibitors、negative miRNA转染BGC-823胃癌细胞24 h。免疫荧光倒置显微镜下观察siRNA转染BGC-823细胞效果(图1)，大多数BGC-823细胞发出绿色荧光，表明siRNA转染成功且效率较高。

图1 siRNA转染BGC-823胃癌细胞结果

2.2 BGC-823细胞凋亡相关蛋白分析 miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分别转染胃癌BGC-823细胞24 h后，Western blotting分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax及Bcl-2的表达水平(图2)，独立重复三次实验，Image J扫描其灰度并经GAPDH灰度值校正后SPSS16.0软件统计分析。实验结果表明miR-421 mimics转染BGC-823后，Caspase-3、Bax蛋白表达分别显著下调1.23倍、1.45倍，而Bcl-2则表达显著上调2.12倍，有统计学意义(t=1.833，P＜0.05)；miR-421 inhibitor转染BGC-823细胞后Caspase-3、Bax表达分别上调2.38倍、3.39倍，而Bcl-2蛋白表达显著下调1.21倍，差异有统计学意义(t=1.613，P＜0.05)。

2.3 siRNA转染对BGC-823细胞肿瘤坏死因子受体的影响 MiR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分别转染胃癌BGC-823细胞24 h后，Western blotting分析细胞表面肿瘤坏死因子受体TNFR-Ⅰ与TNFR-Ⅱ的表达水平(图3)，独立重复三次实验，Image J扫描其灰度并经GAPDH灰度值校正后，SPSS16.0软件统计分析。实验结果表明miR-NA-421 mimics转染胃癌BGC-823细胞后，TNFR-Ⅰ与TNFR-Ⅱ表达分别显著上调1.11倍、2.32倍，差异有统计学意义(t=1.301，P＜0.05)；而miRNA-421 inhibitors转染BGC-823细胞后TNF-Ⅰ与TNFR-Ⅱ表达则分别显著减弱1.09倍、1.54倍，差异有统计学意义(t=1.555，P＜0.05)。

图2 Western blotting分析miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA转染BGC-823细胞后caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平

图3 Western blotting分析miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negativemiRNA转染BGC-823细胞后TNFR-I与TNFR-II的表达结果

3 讨论

Caspase-3蛋白在细胞Fas/FasL信号系统中，可经一系列激酶的作用而活化，或通过切割作用底物从而诱导肿瘤细胞的凋亡。现有的研究结果表明Caspase-3在侵袭性胃癌细胞中的表达强度比原癌细胞高，其表达程度与肿瘤的恶性程度及分化程度密切相关[3]。MiRNA mimics是通过化学方法合成微小RNA，其转染到细胞内可模拟细胞内源miRNA从而增强内源miRNA的功能；同样miRNA inhibitors也是经化学方法修饰过后具有抑制靶细胞miRNA的微小miRNA[4]。研究人员认为肿瘤中的miRNA可能是癌基因的促进因子，反之亦然。Caspase-3在胃癌细胞中的低表达可能与miR-421的过表达密切相关，本研究认为miR-421可能抑制Caspase-3的表达导致胃癌细胞的无序增殖。

Bax和Bcl-2两种蛋白在细胞凋亡的过程中发挥着重要作用，然而多数的细胞凋亡诱导因子均通过Caspase蛋白介导的信号传导途径诱导细胞凋亡[5]。本课题通过miR-421inhibitors、miR-421 mimics转染BGC-823细胞后，对Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白的表达进行分析，实验结果表明BGC-823细胞中的miR-421可调控Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达。TNFR-Ⅰ与TNFR-Ⅱ在胃癌细胞中的阳性率明显高于胃癌细胞邻近的黏膜和正常黏膜组织，TNF-α/TNFR-Ⅰ信号在肿瘤微环境中的活化从而维持肿瘤细胞的未分化状态，促进胃癌的发展。本研究结果表明miRNA-421可增强TNFR-Ⅰ与TNFR-Ⅱ在BGC-823细胞的表达，但miRNA-421调控BGC-823胃癌细胞凋亡相关蛋白表达的具体机制仍需深入研究。

[1]Zeng Y,Wagner EJ,Cullen BR.Both natural and designed microRNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells[J].Mol Cell,2002,9(6):1327-1333.

[2]Gailhouste L,Ochiya T.Cancer-related microRNAs and their role as tumor suppressors and oncogenes in hepatocellular carcinoma [J].Histol Histopathol,2013,28(4):437-451.

[3]Hoshi T,Sasano H,Kato K,et al.Immunohistochemistry of Caspase-3/cpp32 in human stomach and its correlation with ceil proliferation and apoptosis[J].Anticancer Res,1998,18(6A):4347-4353.

[4]Tang G,Tang X.Short tandem target mimic:a long journey to the engineered molecular landmine for selective destruction/blockage of microRNAs in plants and animals[J].J Genet Genomics,2013, 40(6):291-296.

[5]Wei MC,Zong WX,Cheng EH,et al.Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death[J].Science,2001,292(5517):727-730.

Expression analysis of related proteins in the apoptosis of BGC-823 gastric cancer cells regulated by miR-421.

PU Xiong-yong,YAO Yong-liang,SUN Wang-wei,JIANG Yi-biao,WU Jian-hong.Department of Clinical Laboratory, Kunshan People's Hospital Affiliated to Jiangsu University,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo study the molecular mechanism of miR-421 in the apoptosis of BGC-823 gastric cancer cells.MethodsmiR-421 mimics and miR-421 inhibitors were transfected into BGC-823 cells by siRNA transfection technology.The expression of proteins related to apoptosis or receptors such as caspase-3, Bax,Bcl-2,TNFR-Ⅰand TNFR-Ⅱwere detected by Western blotting.ResultsThe miR-421 mimics and miR-421 inhibitors were transfected into BGC-823 cells successfully.The expression of caspase-3 and Bax proteins were enhanced in BGC-823 cells transfected with miR-421 inhibitors,while the expression of Bcl-2,TNFR-Ⅰand TNFR-Ⅱwere decreased.ConclusionThe expression of apoptosis proteins caspase-3,Bax,Bcl-2 and cell surface receptor proteins TNFR are regulated by miRNA-421 to influence the apoptosis of BGCe-823 gastric cancer cells.

Gastric cancer;miR-421;Transfection

R735.2

A

1003—6350（2015）17—2500—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0907

2015-02-23)

昆山市科计划项目（编号：KS1347）

吴健红。E-mail:ejian7054@sohu.com