氧化应激参与调控磷酸三钙磨损颗粒诱导假体周围骨细胞凋亡和自噬

邬珊珊徐璐瑶朱佳慧王灵杰钱煜峰毛红娇张云严明

1绍兴文理学院医学院（浙江绍兴312000）

2杭州电子科技大学生命信息与仪器工程学院（浙江杭州310018）

假体翻修术回顾性研究发现，关节假体植入体内后，经过长期磨损、碰撞会产生大量的聚乙烯（polyeth⁃ylene，PE）、金属钛（titanium，Ti）和陶瓷磷酸三钙（tri⁃calcium phosphate，TCP）等磨损颗粒，这些颗粒会刺激假体周围单核/巨噬细胞、成骨细胞和成纤维细胞等细胞产生大量的炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和前列腺素E2（PGE2），诱导破骨细胞的生成及骨溶解[1，2]。假体周围除了含有上述组织细胞外，还存在着丰富的骨细胞（os⁃teocyte），其数量占骨组织细胞90%～95%。骨细胞均匀分布于矿化的骨基质中，能通过其丰富的伪足彼此连接形成骨细胞网络，维持自身生理功能，合成并分泌DMP-1及SOST等分子调控骨表面的成骨细胞和破骨细胞活动而影响骨重建[3，4]。因此，骨细胞是调控骨新陈代谢的主要细胞。

以往研究和我们前期实验表明磨损颗粒可诱导假体周围骨细胞凋亡，释放TNF-α和核因子κ B受体活化因子配体（RANKL），后者促进破骨细胞活化与骨溶解，而且假体周围骨细胞凋亡先于破骨细胞的活化[5]，因此，关节假体植入后所产生的磨损颗粒能诱导骨细胞受损、凋亡，成为假体周围骨溶解的重要启动者。此外，2016年Wang等[6]报道磨损颗粒可诱导骨细胞自噬，促进破骨细胞生成和骨吸收。以上研究结果表明：磨损颗粒可诱导假体周围骨细胞凋亡和自噬，促进骨假体周围溶解。

有证据显示细胞凋亡、自噬与氧化应激密切相关[7，8]，但是氧化应激在磨损颗粒诱导的假体周围骨细胞凋亡和自噬中的作用如何？目前尚不清楚。本研究应用前期成功构建的TCP磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型，模拟体内关节假体释放的磨损颗粒诱导假体周围骨溶解和无菌性松动病理过程[2]，以小鼠颅骨溶解部位周围骨细胞为研究对象，应用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）探讨氧化应激对TCP磨损颗粒诱导假体周围骨细胞凋亡和自噬中的影响，为防治假体周围骨溶解和关节松动提供新的靶细胞和治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 小鼠颅骨溶解模型的构建[2]与实验分组

ICR雄性小鼠36只，体重18～22 g，清洁级，购自浙江省医学科学院实验动物中心（动物许可证号：SCXK（浙）2014-0001，合格证号1603090018）。实验前将动物置室内适应性饲养1周，温度22°C～24°C，相对湿度50%～70%，动物自由进食进水，自然昼夜节律光照。

随机分为正常组、TCP磨损颗粒（TCP）组和N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）组，每组12只。除正常组外，TCP组和NAC组小鼠分别经腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉小鼠后，无菌条件下取颅顶正中矢状切口，长约0.8 cm，分离皮下组织，露出面积为1 cm×1 cm方形颅骨区域，取TCP磨损颗粒30 mg置于小鼠颅骨中缝骨膜上缝合皮肤构建小鼠颅骨溶解模型。NAC处理组小鼠于术后第2天颅顶皮下注射NAC（1.0 mg/kg），2天1次。持续干预2周后处死动物取血清和颅骨（以正中矢状缝为中心的方形区域）。

1.3 测试指标与方法

1.3.1 HE染色

每组取6只小鼠颅骨，经10%甲醛固定48 h和10%EDTA（pH7.4）脱钙2周后进行石蜡包埋，后经切片机对颅骨矢状面连续切片（5 μm），脱蜡后行HE染色。每只小鼠颅骨随机选取4张切片置于IX70显微镜下观察3个视野中假体周围骨细胞活性及死亡（即空骨陷窝）情况变化，应用Image Pro-Plus 6.0（美国MediaCy⁃bernetics公司）软件分析单位面积内空骨陷窝数目。

1.3.2 ELISA法检测血清骨细胞特征蛋白SOST和DMP- 1水平

各组小鼠分别于实验结束后眼球采血1.0 mL置于EP管中，待血液凝固后于3000 r/min（4°C）离心10 min，取上清液即为血清。利用牙本质基质蛋白1（DMP-1）和硬化蛋白（SOST）试剂盒检测小鼠血清中DMP-1和SOST水平。

1.3.3 骨细胞的获取

参照方法分离骨细胞[9]。每组取6只小鼠颅骨，去除软组织和骨膜后，与0.2%IV型胶原酶溶液（含70 mM NaCl，10 mM NaHCO3，60 mM sorbitol，30 mM KCl，3 mM K2HPO4，1 mM CaCl2，0.1%bovine serum albumin，0.5%glucose和25 mM HEPES）在37°C培养箱中孵育20 min。去除上清液，颅骨碎片在37°C与含5 mM EDTA和0.1%BSA消化液中消化20 min，中间吹打1次。PBS冲洗后，重复以上消化步骤4次，收集最后2步消化后的上清液含有大量的骨细胞。

1.3.4 流式细胞术检测骨细胞细胞凋亡及ROS水平

各组骨细胞重悬于适量PBS中，制成单细胞悬液，分别加入TUNEL（5 μL/管）或DCFH-DA（2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐，10 μmol/L），避光孵育15～30 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞内ROS水平[5]。

1.3.5 骨细胞蛋白提取和比色法检测假体周围骨细胞MDA含量和SOD活性

各组骨细胞加入RIPA（100 μL）裂解液置于冰上裂解30 min。经12000 r/min离心15 min收集上清液即为总蛋白，通过BCA™试剂盒检测各组总蛋白浓度。利用丙二醛（MDA）和SOD试剂盒检测各组骨细胞中MDA含量和SOD活性的变化。

1.3.6 Westernblot检测蛋白表达[10]

各组骨细胞蛋白提取液加入上样缓冲液后煮沸10 min，冷却后每孔上样 30 μg蛋白，行 12%SDSPAGE分离蛋白，电泳完成后将蛋白转移到PVDF膜上，经5%脱脂牛奶常温封闭2 h后，分别加入兔源性一抗 Beclin-1（1:1000）、LC-3（1︰1000）和β-actin（1︰1000）4°C孵育过夜。次日用TBST洗涤3次后加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL显色液；通过凝胶成像系统扫描分析各蛋白变化。

1.4 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni矫正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠假体周围骨细胞损伤情况比较

与正常组比较，TCP组小鼠假体周围骨细胞活性显著下降，空骨陷窝数量明显增加（P＜0.05，图1），血清中骨细胞特征蛋白DMP-1水平降低，SOST水平上升，造成DMP-1/SOST显著减少，仅为正常组的39.20%（P＜0.05，图2）。与TCP组比较，NAC组假体周围空骨陷窝数量及DMP-1/SOST明显增加（P＜0.05，图1、图2）。

图1 HE染色观小鼠假体周围骨细胞活性（n=6）

图2 ELISA法检测小鼠血清中SOST和DMP-1水平（n=12）

2.2 各组小鼠假体周围骨细胞凋亡情况

与正常组比较，TCP组假体周围骨细胞凋亡明显，其凋亡率高达28.02%，为正常组的7.22倍（P＜0.05，图3）。与TCP组比较，NAC组假体周围骨细胞凋亡显著减少，仅为TCP组的32.05%（P＜0.05，图3）。

图3 TUNEL染色流式细胞术定量分析小鼠假体周围骨细胞凋亡（n=6）

2.3 各组小鼠假体周围骨细胞发生氧化应激情况比较

与正常组比较，TCP组小鼠假体周围骨细胞发生氧化应激，表现为骨细胞中MDA和ROS含量明显增加，SOD活性显著降低，分别为正常组的的3.10倍、5.25倍和53.57%（P＜0.05，图4、图5）。与TCP组比较，NAC组假体周围骨细胞中MDA和ROS含量显著降低，SOD活性明显增加。

图4 化学比色法检测小鼠假体周围骨细胞中MDA含量和SOD 活性（n=6）

图5 DCFH-DA染色流式细胞术检测假体周围骨细胞内ROS水平（n=6）

2.4 各组小鼠假体周围骨细胞自噬的活化比较

与正常组比较，TCP组假体周围骨细胞发生自噬，表现为自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3蛋白表达均明显上调，LC-3I向LC-3II转换显著增加，造成LC-3II/LC-3I上升（P＜0.05，图6）。与TCP组比较，NAC组假体周围骨细胞中Beclin-1和LC-3表达显著降低，LC-3I向LC-3II转换也明显减少，LC-3II/LC-3I下降（P＜0.05，图6）。

图6 Western blot法检测小鼠假体周围骨细胞自噬的活化（n=6）

3 讨论

骨细胞的数量、活性及其功能对骨重建起着重要的作用[2，11]，而骨细胞凋亡常常伴随着骨质疏松症和骨关节炎等骨吸收疾病的发生，同时造成骨脆性增加及骨修复能力减弱[10，11]。Emerton等[12]研究发现糖皮质激素可诱导大鼠股骨和肱骨中骨细胞凋亡，增加局部骨吸收及骨脆性。2016年Cabahug-Zuckerman研究小组报道后肢卸载的小鼠股骨皮质骨和骨小梁中骨细胞发生凋亡，骨吸收显著；应用Caspase抑制剂QVD能显著抑制上述骨细胞凋亡和骨吸收[13]。本研究结果显示TCP磨损颗粒可诱导假体周围骨细胞损伤，表现为TCP组假体周围骨细胞死亡、功能损伤和骨细胞凋亡显著（图2、图3），与TCP磨损颗粒所造成的假体周围骨溶解趋势一致[2，6]。提示：骨细胞凋亡参与调控TCP磨损颗粒诱导的假体周围破骨细胞活化和骨溶解。

另有研究证实骨细胞自噬也调控骨吸收。近年有研究显示糖皮质激素诱导的小鼠骨质疏松症模型中骨细胞发生自噬[14]；2014年Yang等[15]也报道去卵巢大鼠胫骨近端的骨细胞自噬水平显著增加，且自噬的活化程度与骨吸收呈正相关。2016年Wang研究发现TiAl6V4颗粒能诱导骨细胞MLO-Y4自噬，而干扰自噬相关基因Atg5可显著抑制破骨细胞生成[6]。与之类似，本实验结果也表明TCP磨损颗粒可诱导假体周围骨细胞发生自噬，自噬标志蛋白Beclin-1和LC-3表达显著增加，LC-3I向LC-3II转换明显（图4）。以上研究结果表明：自噬和凋亡均参与了TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨细胞损伤。

大量研究显示氧化应激参与调控细胞凋亡和自噬[7，8]。氧化应激是指机体自由基、ROS产生过多或机体抗氧化能力减弱，ROS清除不足，体内ROS蓄积超出了机体的清除能力，导致氧化/抗氧化失衡而造成细胞、组织氧化损伤的病理过程。有研究表明松动假体周围组织中ROS水平较高，大量的ROS攻击假体周围组织细胞后引起氧化物质谷胱甘肽（GSH）和MDA等含量增加，改变细胞膜通透性进而诱导氧化应激反应[16-18]。本实验结果也显示TCP磨损颗粒可诱导假体周围骨细胞发生氧化应激，表现为TCP组小鼠假体周围骨细胞内MDA和ROS含量明显增加，抗氧化物质SOD活性显著降低；其氧化应激活化程度类似于地塞米松诱导体外培养骨细胞MLO-Y4产生ROS[19]。另外，我们还发现抗氧化剂NAC能明显减轻TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨细胞凋亡和自噬，与2015年Tak⁃eno等[20]和Fontani等[21]观察到的NAC对血清剥夺或血浆同型半胱氨酸诱导骨细胞MLO-Y4凋亡的影响效果基本一致。但是，对于氧化应激介导的骨细胞凋亡和自噬具体机制如何？还需要我们以后进行深入地研究。

4 结论

氧化应激参与调控TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨细胞凋亡和自噬，促进骨细胞死亡及假体周围骨溶解。