间充质干细胞对破骨细胞形成的影响

韩 健，张莉芸

作者单位:030001太原，山西医科大学附属大医院风湿免疫科

成年人的骨质通过不断去除旧骨并产生新骨而进行重建，破骨细胞和成骨细胞在骨重建过程中发挥着重要作用［1］。破骨细胞可诱导骨小梁和骨皮质表面产生沟槽及隧道，随后成骨细胞产生新的骨基质填充这些沟槽。多种疾病可造成骨破坏的增加，包括绝经后骨质疏松症、牙周炎、Paget病、类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis，RA)及溶解性骨转移等［2］。间充质干细胞 (mesenchyma stem cells，MSCs)为多功能基质细胞，是一种非造血前体细胞。MSCs最初是由Friedenstein等从骨髓中分离而来，为一种成纤维样细胞，具有在体外分化成成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞的能力，移植到体内后可生成骨组织。研究证明MSCs可分泌影响破骨细胞形成及骨再吸收的调节因子。MSCs对破骨细胞形成的作用较复杂并且依赖于其所处的病理生理环境，其作用机制已成为研究热点。

1 破骨细胞及破骨细胞形成

破骨细胞是一种多核细胞，主要来源于骨髓造血干细胞 (bone marrow hematopoietic stem cells，BMHSCs)，也可由单核细胞及巨噬细胞分化而来，可通过溶解羟磷灰石晶体及退化的有机骨成分而促进骨再吸收过程［3］。与巨噬细胞在免疫反应中的作用相似，骨质中的破骨细胞具有吞噬作用，因此称为骨特征性巨噬细胞［4］。此外，破骨细胞在病理条件下具有免疫调节作用，可分泌多种介质，参与炎性骨质丢失过程［5］，因此破骨细胞也是一种免疫细胞。

研究证实，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 受体激活蛋白 (receptor activator of NF-κB，RANK)/NF-κB受体激活蛋白配体 (receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)/护骨因子 (osteoproterin，OPG)系统是与调节破骨细胞分化、成熟和凋亡相关的信号通路。RANKL又称为破骨细胞分化因子或OPG配体，属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF) 家 族 的 一 员［2］。RANKL是生理性骨重建过程中促进破骨细胞分化及活化的关键因子，通过与破骨细胞及其前体细胞表面的RANK结合而促进破骨细胞形成。OPG又称为破骨细胞生成抑制因子 (osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF)，来源于成骨细胞及其他骨髓间充质细胞，属于TNF受体家族中的一员，可干扰RANKL与RANK的结合，从而抑制骨的再吸收过程。因此，RANKL/OPG比值在破骨细胞形成过程中发挥着重要作用。此外，近年来的研究表明，多种促炎细胞因子亦参与了破骨细胞的形成，白细胞介素 (interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-17及TNF-α可促进破骨细胞的形成，而IL-4、IL-10、IL-13、IL-18和干扰素 (interferon，IFN)-γ及IFN-β可抑制其形成。

2 MSCs的免疫调节作用

MSCs可分化为特定类型的细胞，并产生多种可溶性因子以介导损伤组织的再生及修复。已有研究表明，MSCs具有免疫调节功能，在多种生理环境下发挥免疫抑制作用。MSCs可抑制T细胞、B细胞、自然杀伤细胞 (natural killer，NK)及树突状细胞 (dendritic cell，DC) 的增生［6］。目前临床上已将MSCs用于克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、1型糖尿病、同种异体移植排斥反应、移植物抗宿主病等多种疾病的治疗。

研究表明MSCs的免疫抑制活性只有在炎性环境下才会被激活［7］，IFN-γ、TNF、IL-1α 或 IL-1β等因子对MSCs有活化作用［8］。此外，有研究发现IL-17可促进MSCs的免疫抑制活性［9］。值得注意的是，MSCs可根据其所处环境的不同而发挥不同的免疫调节作用，当其所处环境的炎症反应程度较轻时，MSCs可通过产生一些促炎因子募集免疫细胞至炎症部位，从而增强免疫反应。然而，在炎症反应程度较重的情况下，MSCs可抑制不同免疫细胞的增生及功能，从而发挥其免疫抑制作用［10］。研究表明，口服免疫抑制剂可降低MSCs的免疫抑制作用［11］。因此，用MSCs治疗自身免疫性疾病需考虑炎症反应程度、细胞因子类型及免疫抑制剂的使用情况等几个因素。另有研究发现，人类MSCs可抑制CD34+祖细胞的分化，抑制单核细胞分化成为DC以及B细胞分化成为浆细胞的过程，MSCs亦可抑制细胞毒性T淋巴细胞的分化及T细胞分化成为辅助性T17细胞。总之，MSCs在炎症反应程度较轻的条件下具有免疫激活作用，而在炎症反应程度较重的条件下具有免疫抑制作用。

3 MSCs影响破骨细胞形成的体外研究

有研究发现，不成熟的基质细胞及成骨细胞不仅可促进破骨细胞形成，还可表达高水平的RANKL。一项将人类骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)同破骨细胞前体细胞 (CD34+hHSCs)共培养的研究表明，在缺乏糖皮质激素、细胞因子及生长因子的条件下，MSCs可促进 HSCs增生并分化成为破骨细胞。

MSCs可通过其表面蛋白质及分泌可溶性因子以促进破骨细胞的形成。Zhu等［12］将BMMSCs同大鼠CD34+hHSCs与CD11b+单核细胞进行共培养，发现MSCs可通过分泌RANKL、巨噬细胞集落刺激因子 (macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)及IL-6等促破骨细胞形成因子的方式促进破骨细胞形成。此外，Ma等［13］证明MSCs的促破骨细胞形成作用与其所来源骨髓的炎症程度密切相关。MRL/lpr大鼠是一种慢性系统性炎症及骨髓炎症模型鼠，研究发现与轻度骨髓炎症大鼠模型相比，MRL/lpr大鼠的BMMSCs促破骨细胞形成作用增强。但是，MSCs还具有抑制破骨细胞形成的作用。TNF-α是一种促炎细胞因子，可促进破骨细胞形成，因此有学者认为其可增强MSCs的促破骨细胞形成能力。然而，Zhu等［12］将 TNF-α 加入MSCs/单核细胞共培养系统后，破骨细胞形成的数量明显减少，并发现TNF-α可上调MSCs分泌OPG的能力，轻微下调MSCs分泌M-CSF、RANKL及IL-6的能力。由于RA患者的关节滑液中TNF-α表达升高，因此有研究将RA患者的关节滑液同MSCs进行共培养，发现MSCs调节破骨细胞形成的作用同滑液中TNF-α的水平显著相关，当滑液中TNF-α水平较低时，MSCs可促进破骨细胞形成，然而当滑液中TNF-α水平较高时，MSCs可抑制破骨细胞形成［14］。此外，经 TNF-α刺激后的MSCs仍保留着其免疫表型、多向分化潜能及免疫抑制活性，因此TNF-α可调节MSCs对破骨细胞形成的调节作用，是一种增强MSCs免疫抑制作用的促炎介质。

此外，TNF-α以外的其他因子也可能参与了调节MSCs免疫抑制作用的过程。Oshita等［15］将MSCs同外周血单核细胞进行共培养，并加入高剂量的 RANKL及 M-CSF，发现 MSCs可通过分泌OPG以抑制破骨细胞的分化及活性。因此推测RANKL和M-CSF可能同TNF-α一样调节MSCs对破骨细胞形成的作用，使其从促破骨细胞形成转变为抗破骨细胞形成。

Takano等［16］发现，MSCs可通过分泌 OPG及IL-10抑制破骨细胞的形成。IL-10是一种抗炎及免疫抑制因子，不仅在机体发生感染时可抑制组织损伤，还可通过抑制免疫及炎性反应来治疗自身免疫性疾病。IL-10可通过干扰RANKL信号转导通路抑制破骨细胞形成的早期阶段，因此MSCs可通过分泌IL-10发挥抗破骨细胞形成的作用。此外，Takano等还发现MSCs亦可分泌转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1，。TGF-β1在破骨细胞形成及骨再吸收过程中可发挥双相作用，即较低质量浓度的TGF-β1可促进破骨细胞的形成及存活，较高质量浓度的TGF-β1可抑制破骨细胞的形成并促进其凋亡［17］。

Varin等［18］研究发现，MSCs对破骨细胞形成的作用是通过其表面标志物CD200与破骨细胞前体细胞表面的CD200受体 (CD200R)相结合实现的。CD200是最新发现的MSCs表面标志物，是免疫球蛋白超家族的一员，可在多种细胞表面表达，发挥免疫抑制作用［19］，CD200R是一种1型跨膜蛋白，主要表达于单核细胞及巨噬细胞表面［18-19］，二者结合后可触发免疫抑制信号途径，从而诱导不同的免疫调节反应，并通过下调多种免疫细胞，尤其是巨噬细胞的功能而发挥抗炎作用［20］。Varin等［18］证明CD200-CD200R系统可通过抑制其下游的RANK信号转导途径以抑制破骨细胞的形成，CD200表达阳性MSCs的可显著抑制破骨细胞的形成。然而，CD200表达阳性及 CD200表达阴性MSCs均可以表达等量的OPG水平，表明CD200表达阳性MSCs对破骨细胞的抑制作用并不依赖于OPG的分泌水平。上述研究使用的是加入高浓度促破骨细胞形成因子M-CSF及RANKL的培养基，值得注意的是MSCs是否表达CD200与其来源相关。骨髓来源MSCs可表达CD200，然而不同捐献者的MSCs表面CD200表达水平并不相同。脐带血来源的MSCs并不表达CD200［19］，胎儿的MSCs可表达CD200［21］。有研究发现，CD200是内脏脂肪干细胞的潜在标志物［22］，来源于 Wharton胶的MSCs可表达高水平的 CD200［20］。有学者对 MSC表面CD200的抗炎作用进行研究，发现炎症刺激后Wharton胶及脂肪来源的MSCs中CD200表达水平并无明显变化，而BM-MSCs在受到促炎细胞因子刺激后其CD200表达水平升高，INF-α、TNF及IL-1刺激后可有轻微升高，而IFN刺激后CD200水平显著升高［20］。因此，适当来源的 CD200+MSC有望作为多种炎性及自身免疫性疾病的新型治疗方法。

4 关于MSCs影响破骨细胞形成的体内研究

有研究显示，用MSCs移植治疗不同的可导致骨代谢紊乱的炎性疾病，如原发/继发性骨质疏松症及RA等以修复其骨质丢失。将MSCs移植疗法用于糖皮质激素诱导的骨质疏松模型动物，并以佐剂诱导关节炎小鼠模型［15］及系统性红斑狼疮模型MRL/lpr小鼠［13］，发现其可促进骨基质的形成并抑制骨再吸收过程，然而，MSCs移植的治疗靶点尚未证实。Ma等［13］将健康人类的MSCs移植于MRL/lpr小鼠，发现其治疗靶点为小鼠的BMMSCs。在SLE患者及MRL/lpr小鼠模型中，骨髓中促炎细胞因子IL-17水平升高，可促进BMMSCs的破骨细胞诱导能力，而 hMSCs移植后 IL-17水平降低，BMMSCs的功能恢复正常，从而维持骨质的稳态。Park等［23］用 TGF-β 转导的 MSCs对 DBA/1J大鼠建立的CIA模型进行干预，发现其可抑制大鼠关节炎的进展并减少骨及软骨的破坏。此外，TGF-β转导的MSCs还可抑制破骨细胞的分化，因此推测TGF-β可诱导 MSCs的抗破骨细胞形成能力。Koizumi等［24］将来源于骨关节炎 (osteoarthritis，OA)或RA患者的滑液间充质干细胞移植于RA/OA患者，发现患者关节软骨损伤程度明显缓解。这些体内研究表明，MSCs移植可通过抑制破骨细胞形成而减少受体骨与软骨的破坏，且TGF-β转导后MSCs的抗破骨细胞形成能能力增强。此外多项研究表明，将MSCs移植至野生型老鼠后并不能对其骨代谢产生影响，证明受体的炎性环境在MSCs移植后的骨代谢修复过程中发挥重要作用。

5 结论

基于上述研究结果，可以发现MSCs对破骨细胞的形成具有双重作用，这种作用依赖于其所处的微环境。在实验培养基中不加入或仅加入少量的M-CSF及RANKL等促破骨细胞形成因子后，MSCs可刺激破骨细胞的形成。然而，在实验培养基中加入大量的M-CSF及RANKL等促破骨细胞形成因子后，MSCs可抑制破骨细胞的形成。

将TNF-α加入MSCs/单核细胞培养基可使得MSCs促破骨细胞形成作用转变为抑制作用;在诱导破骨细胞形成的培养基中加入MSCs可显著抑制破骨细胞的形成。因此，可以假设，在培养基中加入高质量浓度的促破骨细胞形成因子来模拟体内的炎性病理环境可刺激MSCs发挥其抑制破骨细胞形成作用，这种假设为治疗炎症诱导的骨质丢失提供了新的思路，但其可能性有待于进一步研究加以证明。