右美托咪定通过影响CHOP凋亡通路减轻缺血/再灌注肺损伤*

陈　丹，宋　冬，叶玉柱，何金波，陈　磊，邱晓晓，林丽娜△，王万铁△(温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所，附属第一医院麻醉科，浙江温州35035)



右美托咪定通过影响CHOP凋亡通路减轻缺血/再灌注肺损伤*

陈丹1，2▲，宋冬1▲，叶玉柱2，何金波1，陈磊2，邱晓晓1，林丽娜2△，王万铁1△
(温州医科大学1缺血/再灌注损伤研究所，2附属第一医院麻醉科，浙江温州325035)

［摘要］目的:探讨右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)能否通过CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)凋亡通路减轻小鼠缺血再灌注(I/R)性肺损伤。方法:选取雄性8～10周龄C57BL/6J小鼠40只，体重18 ～22 g，复制在体左肺I/R损伤模型。随机分为4组:假手术组(sham组)，I/R模型组(I/R组)，生理盐水对照组(I/R+ NS组)，右美托咪定干预组(I/R+ DEX组)。DEX组在小鼠左肺缺血前30 min腹腔注射DEX 25 μg/kg，I/R+ NS组给予与DEX等体积的生理盐水。实验毕，留取左肺组织。测定肺组织干湿比(W/D)及总肺含水量(TLW)，行肺组织损伤评估(IQA)，光、电镜观察肺组织形态学及超微结构改变。原位末端标记(TUNEL)法检测组织细胞凋亡指数(AI)。Western blot和逆转录PCR(RT-PCR)分别检测CHOP、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白和mRNA表达量。结果:与sham组比，I/R组和I/R+ NS组肺W/D、TLW、IQA、AI明显升高(P＜0.01)，肺组织形态破坏显著，CHOP、GRP78蛋白和mRNA表达量增加(P＜0.01) ; I/R组与I/R+ NS组相比，上述指标无显著差异。与I/R组比，I/R+ DEX组肺组织W/D、TLW、IQA及AI明显下降(P＜0.05)，组织损伤明显减轻，CHOP蛋白和mRNA表达量下降(P＜0.01)。结论: DEX可有效减轻小鼠缺血/再灌注性肺损伤，其机制可能与其抑制CHOP通路所致凋亡有关。

［关键词］右美托咪定;缺血/再灌注;肺损伤; CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白;细胞凋亡

［修回日期］2015-03-30

▲并列第1作者

Dexmedetomidine alleviates lung ischemia-reperfusion injury through CHOP pathway in mice

CHEN Dan1，2，SONG Dong1，YE Yu-zhu2，HE Jin-bo1，CHEN Lei2，QIU Xiao-xiao1，LIN Li-na2，WANG Wan-tie1
(1Institute on Ischemia/Reperfusion Injury，2Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail: wwt@ wzmc.edu.cn; wzlinlina@ tom.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effect of dexmedetomidine (DEX) on the CCAAT/enhancer-binding proteinhomologous protein (CHOP) pathway during lung ischemia-reperfusion (I/R) in mice.METHODS: C57BL/6J male mice were randomly divided into sham operation group (sham group)，lung ischemia/reperfusion group (I/R group)，ischemia/reperfusion+ normal saline group (I/R+ NS group) and ischemia/reperfusion+ dexmedetomidine group (I/R+ DEX group).Dexmedetomidine was infused intraperitoneally with 25 μg/kg for 30 min prior to the ischemia period in I/R+ DEX group，the normal saline was administrated with the same volume of dexmedetomidine in I/R+ NS group.After finished the 3 h-reperfusion period，the left lung tissues were harvested to determine lung wet/dry weight (W/D)，the total lung water content (TLW)，and index of quantitative evaluation for alveolar damage (IQA).Morphological observation and terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) were applied to evaluate the structure changes and the apoptosis index (AI) of the lung tissues.The expression of CHOP and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at mRNA and protein levels in the lung tissues was detected by Western blot and RT-PCR.RESULTS: Compared with sham group，the W/D，TLW，IQA，AI，the mRNA and protein expression of CHOP and GRP78 obviously increased，and the left lung tissues structure were damaged more obviously both in I/R group and I/R+ NS group.Compared with I/R group，the W/D，TLW，IQA，AI and the protein and mRNA expression of CHOP in I/R+ DEX group decreased，the injury of the left lung tissue structures induced by I/R in I/R+ DEX group were also alleviated.CONCLUSION: DEX alleviates thelung I/R injury，which may be related to inhibition of apoptosis mediated by CHOP pathway.

［KEY WORDS］Dexmedetomidine; Ischemia/reperfusion; Lung injury; CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein; Apoptosis

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)肺损伤已成为临床肺移植及心肺转流等术后并发症的明确原因，常导致组织细胞发生凋亡［1-3］，研究表明其机制与过度内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)导致的未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)有关［4］。因此，如何减轻和避免I/R损伤可为临床防治提供新方案和思路。机体在缺血、缺氧、钙超载等情况下，内质网发生过度应激，UPR凋亡通路被激活，细胞发生凋亡，进而损伤组织。其中CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)为UPR的主要凋亡信号分子，在机体内质网应激条件下大量表达，目前认为CHOP促凋亡作用与其抑制抗凋亡因子Bcl-2表达有关［5-6］。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)为α2肾上腺素能受体激动剂，具有器官保护、抗炎、抗凋亡等作用［7］，本实验旨在研究右美托咪定预处理能否抑制CHOP凋亡途径，影响CHOP和葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)的表达，减轻小鼠I/R性肺损伤，为临床预防和治疗I/R性肺损伤提供新的治疗靶点及途径。

材料和方法

1实验动物

SPF级C57BL/6J小鼠，8～10周龄，雄性，体重18～22 g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号为SYXK(浙) 2012-075。

2药品及试剂

右美托咪定(江苏恒瑞医药股份有限公司) ; DNase I、proteinase K(Sigma) ; TUNEL检测试剂盒(Roche) ; DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司) ; Trizol(Invitrogen) ;逆转录试剂盒、PCR试剂盒(Fermentas) ; BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所) ;兔抗GAPDH多克隆IgG抗体(杭州至贤生物科技有限公司) ; CHOP、GRP78 (Cell Signaling Technology) ; HRP偶联山羊抗兔IgG抗体(Abcam)。

3实验方法

3.1动物模型的建立模型复制参考文献中方法［8］进行，小鼠麻醉后，仰卧位固定，消毒，行倒T型气管切开术，植入20 G注射针套管，连接呼吸机，调节呼吸参数。于左侧2、3肋间体表处，消毒切皮，逐层钝性分离至胸腔，显露左肺门，用微型动脉夹夹闭30 min，即缺血期;继之松开动脉夹，为再灌注期，时长3 h。实验毕，处死小鼠，留取左肺组织。假手术小鼠仅开胸不夹闭左肺门，其余操作步骤相同，实验结束处死小鼠，留取左肺。术中维持体温在36.5～37.5℃。

3.2实验分组SPF级C57BL/6J小鼠40只，随机分为4组:假手术组(sham组)、肺缺血/再灌注组(I/R组)、生理盐水对照组(I/R+ NS组)、右美托咪定组(I/R+ DEX组)。I/R+ DEX组缺血前30 min腹腔注射DEX(25 μg/kg)，I/R+ NS组注射与I/R+ DEX组同体积的生理盐水，其余操作同I/R组。实验结束，处死小鼠，留取左肺组织待检。

3.3肺干湿比(wet weight to dry weight of lung tissue，W/D )及总肺水含量(total lung water content，TLW)值测定实验结束，获取小鼠左肺上叶组织，漂洗，吸除表面血液和水分，称重，记为湿重(wet weight，W)，置于80℃恒温烤箱48 h，称重，记为干重(dry weight，D)。以(W－D)/D计算TLW。

3.4肺泡损伤的检测及光镜观察取小鼠左肺下叶组织，大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，漂洗，固定。常规石蜡包埋，组织切片，HE染色，光学显微镜(× 200)观察肺组织形态学变化，并计数。随机选取50个视野，连续观察，肺泡内红细胞和(或)白细胞数大于2个或肺泡内有水肿渗出者视为损伤细胞，每视野内损伤肺泡数占总肺泡数百分比即为肺泡损伤定量评估指标(index of quantitative evaluation for alveolar damage，IQA)。

3.5肺组织的电镜观察取小鼠左肺尖处肺组织，切成1 mm×1 mm×1 mm大小，2.5%戊二醛保存，固定、块染后，梯度乙醇脱水，丙酮浸泡，Epon 812包埋聚合，行半薄切片，修块，超薄切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，电镜下读片。

3.6 TUNEL检测按照试剂盒说明书操作，光镜下(×400)观察计数，胞核呈棕褐色者为凋亡细胞。

3.7蛋白表达量的Western blot检测取小鼠肺组织100 mg用液氮加以研磨，以1 000 μL RIPA(含10 μL PMSF)裂解组织，待研磨充分后，吸取匀浆液低温离心，取上清，BCA法测定蛋白浓度，绘制标准曲线，样品蛋白均调配成2 g/L，煮沸变性5 min。配胶进行电泳，上样量30 μg，蛋白转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST漂洗，加入I抗(CHOP、GRP78、GAPDH均以1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗涤5 min 3次，加HRP标记II抗(CHOP 1∶3 500，GRP78 1∶4 500，GAPDH 1∶4 000)，室温孵育1 h。TBST洗涤7 min 3次，滴加ECL工作液，反应5 min，暗室内曝光，显影、定影。凝胶分析软件分析目的蛋白与内参照蛋白GAPDH吸光度值。

3.8 mRNA表达量的检测取100 mg小鼠肺组织，加液氮研磨，以TRIzol法提取总RNA，测定RNA浓度，按照RT-PCR试剂盒说明书进行cDNA合成及扩增，PCR参数为94℃1 min; 94℃30 s，50～58℃［CHOP(55℃)，GAPDH(58℃)，GRP78(50℃)］30 s，72℃30 s，72℃10 min，循环31次。引物序列见表1。

表1　目的基因引物序列Table 1.The primer sequences of the target genes

4统计学处理

使用SPSS 15.0软件分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间采用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验，以为差异有统计学意义。

结果

1各组肺组织W/D、TLW、IQA比较

与sham组比，I/R组和I/R+ NS组W/D、TLW、IQA值明显上升(P＜0.01)，I/R组和I/R+ NS组相比，两者无统计学差异(P＞0.05) ;与I/R组比，I/R+ DEX组上述指标明显下降(P＜0.01)，见表2。

2肺组织光镜观察结果

Sham组肺泡结构完整，间质未见增厚，无炎症细胞浸润; I/R组和I/R+ NS组肺泡结构严重破坏，间质明显增厚，大量炎症细胞浸润，肺泡腔内见明显渗出和水肿，可见肺不张; I/R+ DEX组肺泡清晰可见，结构相对完整，鲜见炎症浸润及水肿渗出，间质无增厚。箭头所指为损伤部位，见图1。

表2　各组肺组织W/D、TLW、IQA的变化Table 2.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the W/D，TLW and IQA in the lung tissues of the mice with I/R injury (Mean±SD.n=10)

Figure 1.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the histomorphology changes of the lung tissues in the mice with I/R injury (HE staining，×200).图1肺组织形态学变化

3肺组织透射电镜观察结果

Sham组肺泡II型上皮细胞内板层小体及线粒体等细胞器结构完整，形态良好，清晰可见。I/R组和I/R+ NS组肺泡II型上皮细胞破坏严重，微绒毛少见，板层小体可见空泡化;与I/R组比，I/R+ DEX组肺泡上皮细胞损伤减轻，结构完整性尚可，板层小体偶有空泡化，不如I/R组严重，线粒体稍有肿胀，但仍易发现，见图2。

Figure 2.Ultra-structure of alveolarⅡtype cells in the lung tissues of the mice with different treatments.图2各组肺组织肺泡Ⅱ型细胞超微结构的变化

4肺组织内TUNEL法检测细胞凋亡

Sham组凋亡细胞最少; I/R组、I/R+ NS组最为严重，其中以血管内皮细胞凋亡较为明显，肺泡细胞内也有大量凋亡细胞呈现; I/R+ DEX组凋亡相对较弱，较I/R和I/R+ NS组改善明显。图中棕褐色颗粒皆为凋亡阳性细胞，见图3。

Figure 3.The apoptosis in the lung tissues of mice with I/R injury detected by TUNEL (×400).图3 TUNEL法检测各组肺组织的细胞凋亡

5各组肺组织内的CHOP和GRP78蛋白的表达

与sham组比，其余各组CHOP和GRP78蛋白水平均明显上升(P＜0.01) ; I/R组与I/R+ NS组蛋白上升水平相比无明显差异;与I/R组比，I/R+ DEX组CHOP蛋白水平下降趋势明显(P＜0.01)，见图4。

6各组肺组织内CHOP和GRP78 mRNA表达

与sham组比，其余各组肺组织中CHOP和GRP78的mRNA水平明显上升(P＜0.01) ; I/R组与I/R+ NS组mRNA上调程度一致;经DEX预处理后，CHOP mRNA表达量减少(P＜0.01)，见图5。

Figure 4.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the protein levels of CHOP and GRP78 in the lung tissues of the mice with I/R injury.Mean±SD.n=10＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group.图4各组肺组织CHOP和GRP78蛋白表达水平

Figure 5.The mRNA expression of CHOP and GRP78 in the lung tissues of the mice with I/R injury.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group.图5各组肺组织CHOP和GRP78的mRNA表达水平

讨论

近年来，凋亡机制的研究多关注于内质网途径。研究证实:肺组织I/R诱发过度内质网应激，细胞凋亡参与肺组织缺血再灌注损伤的发生［9-11］。本实验组前期实验证实:小鼠左肺I/R后，肺组织CHOP凋亡通路蛋白和mRNA表达上调［10］。正常情况下，机体内CHOP表达量很低，而应激情况下，其产生量迅速增加，被称为是ERS的标志分子。CHOP诱导凋亡的途径主要与过表达的CHOP破坏Bcl-2与Bax之间的平衡关系、促进Bax移位到线粒体和抑制Akt的活性等有关［12-15］。

内质网膜中，GRP78作为分子伴侣与ER中错误折叠和未折叠蛋白结合，对于其功能的正常运转功不可没，可作为ERS发生的哨兵分子。ERS下，GRP78可游离并迅速增加，结合ER内负荷的错误蛋白，保护ER功能，因而在一定程度的损伤和应激情况下，其表达量会随之上升［15-16］。本实验中，sham组GRP78的产生量处于低位水平，I/R组则明显高出sham组，提示肺I/R诱发ER应激反应。但ER持久和(或)过强的应激也会导致GRP78防御能力发生崩溃，机体丧失自我修复能力，最终宣告凋亡发生。

DEX对心、脑、肺等多种I/R器官具有保护效应，其保护机制多涉及减少自由基生成、抑制炎症细胞产生、降低机体内的儿茶酚胺产生量、抑制交感神经的兴奋性、调节凋亡等［7］。DEX可减少Bax表达，增加Bcl-2的产生起到抗凋亡的作用［17］。在本研究中，I/R使肺内CHOP通路被迅速活化，CHOP、GRP78蛋白及mRNA量明显提升;经DEX预处理后，CHOP的蛋白和mRNA水平下降显著，表明DEX经由CHOP凋亡通路干预I/R诱导的肺损伤，保护肺组织。

DEX缺血前预处理与缺血后处理效果相差甚大，缺血后处理效果不佳［18］，这也是本实验采用缺血前预处理的原因。此外，实验发现，小鼠肺在I/R后，肺组织损伤及凋亡明显，表明在I/R早期，凋亡即参与肺损伤。本实验中，小鼠I/R肺经DEX干预后，UPR相关凋亡蛋白CHOP表达下调，而GRP78蛋白表达增加，证实了DEX通过抑制UPR-CHOP凋亡通路，改善I/R肺损伤。在I/R和非I/R性肺损伤模型中，DEX预处理获得良好的肺保护效果。DEX对缺血再灌注器官的保护作用是通过激活α2肾腺素能受体发挥效应，但是与受体A、B、C 3个亚型中的哪些亚型结合，需要进一步的研究。因此，我们可以推测，DEX抗I/R肺凋亡作用可能是多种途径、多种模式共同或相互作用的结果。

本文主要研究DEX对左肺缺血再灌注损伤后左肺组织的保护作用，右侧肺组织的变化另作专门研究，在此不做详述。

综上所述，右美托咪定预处理可减轻小鼠缺血/再灌注性肺损伤，其作用机制与抑制CHOP通路诱发的凋亡有关。

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通讯作者△林丽娜Tel:0577-55579095; E-mail: wzlinlina@ tom.com;王万Tel:0577-86689817; E-mail: wwt@ wzmc.edu.cn

*［基金项目］浙江省公益技术应用研究项目(No.2013C33168) ;浙江省中医药重点学科建设计划项目(No.2012-XK-A28)

［收稿日期］2014-10-27

［文章编号］1000-4718(2015)06-1093-06

［中图分类号］R363.2

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.022