环丙沙星联用磷霉素抗尿路感染耐药铜绿假单胞菌的协同作用体外研究

宋 洁，何召云，宫海燕，许思权，陈先华

（1.中国人民解放军第三军医大学西南医院预防保健科，重庆 400038；2.中国人民解放军302医院肝硬化诊疗中心，北京 100039）

环丙沙星联用磷霉素抗尿路感染耐药铜绿假单胞菌的协同作用体外研究

宋 洁1，何召云2，宫海燕1，许思权1，陈先华1

（1.中国人民解放军第三军医大学西南医院预防保健科，重庆 400038；2.中国人民解放军302医院肝硬化诊疗中心，北京 100039）

目的 观察环丙沙星和磷霉素联合应用抗尿路感染耐药铜绿假单胞菌的体外协同作用。方法 采用常规方法进行细菌分离和菌种鉴定。最低抑菌浓度（MIC）测定采用微量肉汤稀释法，联合抑菌浓度指数（FICI）测定采用棋盘法。结果 82株耐环丙沙星铜绿假单胞菌中，环丙沙星和磷霉素联合应用对22株细菌有协同抗菌作用，占26.83%。急性杀菌作用中，选取环丙沙星和磷霉素联合应用后协同抗菌作用和环丙沙星 MIC降低均最明显的铜绿假单胞菌P34和P58作为研究对象，结果在药物处理8 h时，环丙沙星和磷霉素联合处理组的细菌数明显低于两种药物单独处理组。浊度试验结果显示，药物处理3 h后，联合用药组与单独用药组细菌浊度出现明显差异。结论 环丙沙星和磷霉素联合应用不但具有抗耐环丙沙星铜绿假单胞菌的协同作用，且具有较强的杀菌效果和溶菌作用。

尿路感染；环丙沙星；磷霉素；铜绿假单胞菌；协同作用

尿路感染约占院内感染的40%，由于发病率高，不但会增加患者死亡率，还会增加患者的精神负担和经济负担，已引起临床高度关注［1］。大肠埃希菌仍是医院或社区获得性简单尿路感染中最常见的细菌病原体，然而在复杂的尿路感染中，仅20%左右的感染由大肠埃希菌引起，铜绿假单胞菌是最重要的病原菌［2］。尤其在长期留置导尿管的患者中，约35%的导尿管相关尿路感染由铜绿假单胞菌引起［3］。大多数铜绿假单胞菌具有较高的耐药性，且可在抗菌药物治疗过程中获得新的耐药性或形成细菌生物膜，使得尿路感染反复发作、迁延难愈。目前，临床口服喹诺酮类药物的广泛应用，导致铜绿假单胞菌耐药性的出现［4－5］。磷霉素是一种天然的抗菌剂，具有广谱的抗菌活性［6－7］。磷霉素因其良好的稳定性、理想的药代动力学参数、良好的耐受性和临床疗效，已成功地用于治疗简单的尿路感染［8］。环丙沙星与磷霉素联合应用，对囊性纤维化患者感染的铜绿假单胞菌有协同抗菌作用［9］。然而，这两种抗菌药物联合应用对尿路感染的铜绿假单胞菌的协同作用鲜有报道。为此协同作用，笔者以耐环丙沙星的铜绿假单胞菌为研究对象，检测其联合抑菌浓度指数（FICI）和急性杀菌作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源、药物、试剂与设备

82株耐环丙沙星铜绿假单胞菌临床菌株分离于西南医院尿路感染患者的临床送检标本，剔除同一患者的重复菌株。根据《美国临床实验室标准化委员会（NCCLS，2010）标准》，环丙沙星对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度（MIC）≥4 μg／mL定义为耐药。质控菌株铜绿假单胞菌（ATCC27853，中国药品生物制品检定所）。环丙沙星（CIP，中国食品药品检定研究院）；磷霉素（FOS，Sigma公司）。营养琼脂平板（重庆庞通医药器材公司）；MH培养基（北京陆桥生物技术有限公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（英国Oxoid公司）。VITEK－2型全自动细菌分析仪（法国生物梅里埃公司）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 MIC和FICI检测

抗菌药物对铜绿假单胞菌的 MIC检测采用微量肉汤稀释法。细菌划线接种于营养琼脂平板上，37℃培养过夜；挑取菌落于0.9%氯化钠注射液3～5 mL校正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释成1∶100，使含菌量为106cfu／mL。抗菌药物用MH肉汤2倍稀释成一系列质量浓度（0.5～1 024.0 μg／mL）。然后每孔加100 μL菌液和100 μL系列质量浓度的抗菌药物，使得药物最终质量浓度为0.255～12.0 μg／mL。96孔板置37℃培养箱孵育16～20 h后观察结果。

FICI测定采用棋盘法。FICI＝环丙沙星联合时的 MIC／环丙沙星单用时的 MIC＋磷霉素联合时的 MIC／磷霉素单用时的MIC。FICI≤0.5为协同作用，0.5＜FICI≤4.0为无关作用，FICI＞4.0为拮抗作用。

1.2.2 杀菌作用

选取环丙沙星和磷霉素联合应用时，协同作用和环丙沙星MIC降低均最明显的铜绿假单胞菌P34和P58作为研究对象。细菌首先接种于LB平板，37℃培养18 h；分别挑取单菌落于10 mL LB培养基，37℃恒温震荡培养18 h；取100 μL过夜培养物转接于10 mL LB培养基，37℃、200 r／min下震荡培养2 h。每个菌株均分为空白对照组、环丙沙星组、磷霉素组、环丙沙星＋磷霉素组。空白对照组不加药物，其他各组药物的终浓度均为1／2 MIC。然后分别于0，2，4，6，8，10 h时取样100 μL，菌液适当稀释后均匀涂布于LB平板上，37℃培养过夜后进行菌落计数。所有试验均重复3次。

1.2.3 浊度试验

分别取铜绿假单胞菌P34和P58的上述过夜培养物100 μL，转接于10 mL LB培养基，在37℃及200 r／min下振荡培养2 h。试验分为空白对照组、环丙沙星组、磷霉素组、环丙沙星＋磷霉素组。环丙沙星和磷霉素药物终浓度均为1／2 MIC。细菌分组处理后分别于每1 h取样100 μL，连续取样9 h，用酶标仪检测其在570 nm波长处的吸光度值（OD570）。

2 结果

2.1 两药联用的FICI测定结果

82株耐环丙沙星铜绿假单胞菌中，FICI≤0.5者 22株（26.83%），0.5＜FICI≤4.0者60株（73.17%），FICI＞4.0者0株（0）。环丙沙星和磷霉素联合对耐环丙沙星铜绿假单胞菌均无拮抗作用。

2.2 两药联用对铜绿假单胞菌的杀菌作用

结果见表1和图1。联合用药后，环丙沙星对铜绿假单胞菌P34和P58的 MIC降低至不超过8 μg／mL，联合用药对这两株菌的FICI分别为0.250和0.375，具有较好的协同作用。菌株P34在8 h时，空白对照组的细菌数为lg 9.2 cfu／mL，环丙沙星和磷霉素单独处理组分别为lg 7.2和lg 7.0 cfu／mL，而环丙沙星和磷霉素联合处理组为lg 3.5 cfu／mL。菌株P58在8 h时，空白对照组的细菌数为lg 9.6 cfu／mL，环丙沙星和磷霉素单独处理组分别为lg 7.4 cfu／mL和lg 7.8 cfu／mL，而环丙沙星和磷霉素联合处理组为lg 4.7 cfu／mL。

表1 环丙沙星与磷霉素单用和联用对铜绿假单胞菌P34和P58的 MIC和FICI

2.3 两药联用对细菌浊度的影响

联合用药对细菌浊度的影响见图2。菌株P34和P58分组培养3 h后，联合用药组的细菌浊度显著低于单独用药组。

图1 环丙沙星与磷霉素联用对铜绿假单胞菌的杀菌作用

图2 环丙沙星与磷霉素联用对细菌浊度的影响

3 讨论

铜绿假单胞菌是院内感染的重要条件致病菌，是引起免疫抑制、恶性肿瘤、囊性纤维化、烧伤及尿路感染患者死亡的重要原因［10］。在铜绿假单胞菌引起的尿路感染患者中，敏感菌株引起的死亡率达23%，而多重耐药菌株引起的死亡率高达67%［11］。因此，多重耐药铜绿假单胞菌的出现为尿路感染患者的治疗带来了巨大挑战。国内外均有研究［10，12－13］表明，不同种类抗菌药物联合应用抗铜绿假单胞菌具有协同作用。本试验中，环丙沙星和磷霉素联合应用后，对22株（26.83%）耐环丙沙星铜绿假单胞菌表现出协同作用，无拮抗作用，与国外研究［9］报道基本一致。这表明抗菌药物联合应用后，对铜绿假单胞菌的抑制作用显著优于单一抗菌药物的使用。铜绿假单胞菌的一个固有耐药性是其细胞壁具有低渗透性，从而能限制抗菌药物的进入。联合抗菌药物对铜绿假单胞菌生长的影响试验表明，环丙沙星和磷霉素联合应用比单独使用具有更好的杀菌效果和溶菌作用。这可能是由于环丙沙星能破坏细菌的细胞壁，而磷霉素可增加细胞壁的渗透作用。Hiromi等［14］和Koichi等［15］报道，氧氟沙星和磷霉素联用抗铜绿假单胞菌具有协同作用。这充分表明磷霉素能通过影响细胞壁合成来改变铜绿假单胞菌的膜渗透性。近年来，多重耐药铜绿假单胞菌引起的尿路感染患者数量不断增加，然而临床几乎无有效的抗菌药物可对抗这些耐药菌株。本研究结果为磷霉素和环丙沙星联合应用对尿路感染耐药铜绿假单胞菌的协同抗菌作用研究和开发更为有效的治疗方案提供了线索，但仍需进一步深入研究。

［1］Mittal R，Aggarwal S，Sharma S，et al.Urinary tract infections caused by Pseudomonas aeruginosa：a minireview［J］.J Infect Public Health，2009，2（3）：101－111.

［2］Moore KN，Day RA，Albers M.Pathogenesis of urinary tract infections：a review［J］.J Clin Nurs，2002，11（5）：568－574.

［3］Ronald A.The etiology of urinary tract infection：traditional and emerging pathogens［J］.Dis Mon，2003，49（2）：71－82.

［4］Coban AY，Ekinci B，Durupinar B.A multidrug efflux pump inhibitor reduces fluoroquinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates［J］.Chemotherapy，2004，50（1）：22－26.

［5］Drago G，Vecchi ED，Nicola L，et al.Activity of levofloxacin and ciprofloxacin in combination with cefepime，ceftazidime，imipenem，piperacillin－tazobactam and amikacin against differentPseudomonas aeruginosa phenotypes and Actinetobacter spp［J］.Chemotherapy，2004，50（4）：202－210.

［6］Karageorgopoulos DE，Wang R，Yu XH，et al.Fosfomycin：evaluation of the published evidence on the emergence of antimicrobial resistance in Gram－negative pathogens［J］.J Antimicrob Chemother，2012，67（2）：255－268.

［7］Falagas ME，Maraki S，Karageorgopoulos DE，et al.Antimicrobial susceptibility of Gram－positive non－urinary isolates to fosfomycin［J］.Int J Antimicrob Agents，2010，35（5）：497－499.

［8］Cai Y，Fan Y，Wang R，et al.Synergistic effects of aminoglycosides and fosfomycin on Pseudomonas aeruginosa in vitro and biofilm infections in a rat model［J］.J Antimicrob Chemother，2009，64（3）：563－566.

［9］Figueredo VM，Neu HC.Synergy of ciprofloxacin with fosfomycin in vitro against Pseudomonas isolates from patients with cystic fibrosis［J］.J Antimicrob Chemother，1988，22（1）：41－50.

［10］Yasmin F，Akhtar N，Hameed A.In vitro synergistic effect of ciprofloxacin with aminoglycosides against multidrug resistant－Pseudomonas aeruginosa［J］.Pak J Pharm Sci，2013，26（5）：1 041－1 044.

［11］Obritsch MD，Fish DN，MacLaren R，et al.Nosocomial infections due to multidrug－resistant Pseudomonas aeruginosa：epidemiology and treatment options［J］.Pharmacotherapy，2005，25（10）：1 353－1 364.

［12］Walkty A，Karlowsky JA，Adam H，et al.In vitro activity of ceftolozanetazobactam against Pseudomonas aeruginosa isolates obtained from patients in Canadian hospitals in the CANWARD study，2007 to 2012［J］. Antimicrob Agents Chemother，2013，57（11）：5 707－5 709.

［13］卢亚林，万 军，周丽娜.头孢曲松和庆大霉素对铜绿假单胞菌协同作用的探讨［J］.实用医技杂志，2006，13（20）：3 574－3 575.

［14］Kumon H，Ono N，Iida M，et al.Combination effect of fosfomycin and ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm［J］.Antimicrob.Agents Chemother，1995，39（5）：1 038－1 044.

［15］Monden K，Ando E，Iida M，et al.Role of fosfomycin in a synergistic combination with ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm［J］.J Infect Chemother，2002，8（3）：218－226.

On the In Vitro Synergistic EffectofCiprofloxacin Combined with Fosfomycin against Drug-Resistant Pseudomonas Aeruginosa Isolates from Urinary Tract Infections

Song Jie1，He Zhaoyun2，Gong Haiyan1，Xu Siquan1，Chen Xianhua1
（1.Department of Prevention and Health Care，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，China 400038；
2.Liver Cirrhosis Diagnosis and Therapy Center，302 Hospital of PLA，Beijing，China 100039）

ObjectiveTo investigate the in vitro synergistic effect of ciprofloxacin combined with fosfomycin on ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from urinary tract infections.MethodsThe isolation and identification of Pseudomonas aeruginosa were performed by using the traditional procedures.The minimum inhibitory concentration（MIC）testing was determined by using the microdilution broth method.The fractional inhibitory concentration index（FICI）was tested by using the checkerboard method.ResultsAmong the 82 ciprofloxacin-resistantPseudomonas aeruginosa isolates，the synergistic effect of ciprofloxacin combined with fosfomycin was observed in 22 strains（26.83%）.In the acute bactericidal effect experiments，Pseudomonas aeruginosa isolates P34 and P58 as the most obvious synergistic effect and the reduced MIC of ciprofloxacin were selected as the research subjects.The results showed that the viable cell count at 8 h after medication treatment in the ciprofloxacin and fosfomycin combination treatment group was significantly fewer than that of the single drug treatment group.The turbidity test results showed that the significant difference at 3 h after medication treatment was observed between the ciprofloxacin and fosfomycin combination treatment group and the single drug treatment group.ConclusionThe combination of ciprofloxacin and fosfomycin not only induces a synergistic effect on ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa strains，but also has a strong bactericidal effect and bacteriolytic effect.

urinary tract infections；ciprofloxacin；fosfomycin；Pseudomonas aeruginosa；synergistic effect

R915；R969.3；R978.69

A

1006－4931（2015）02－0036－03

宋洁（1981－），女，主管医师，主要从事预防保健工作，（电子信箱）song＿songjie＠163.com。

2014－07－28）