两种免疫调节剂增强弓形虫W2b2a 表位疫苗的小鼠保护作用①

谢荣华 谭 逵 吴 翔 舒衡平 (湖南环境生物职业技术学院，衡阳 421005)

弓形虫是一种人畜共患胞内寄生的机会致病性原虫，能感染人类及温血动物，引起人兽共患弓形虫病，目前尚无理想的药物治疗弓形虫病，研究弓形虫疫苗预防弓形虫病是目前此领域的热点。弓形虫疫苗有单表位和多表位疫苗，是利用基因重组技术将一个或者多个弓形虫抗原表位的编码基因连接在一起制成的疫苗，但单用弓形虫疫苗的保护性效果不太理想，可用免疫调节剂来增强弓形虫疫苗的免疫原性，产生更有效和持久的保护性免疫。本研究组在前期已成功构建了弓形虫W2b2a 表位疫苗质粒，能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染的保护性免疫［1］。匹多莫德(Pidotimod)化学名为(R)-3-［(S)-(5-氧-2-吡咯烷基)羰基］-噻唑烷基-4-甲酸，由焦谷氨酸和四氢噻唑羧酸两个氨基酸组成的二肽，是一种全新的化学合成免疫调节剂，既能促进非特异性免疫反应又能促进特异性免疫反应［2］。沙利度胺(Thalidomid)化学名为3-邻苯二甲酰亚胺基戊二酰亚胺，这是一个老药新用的免疫调节剂，它能特异的调节肿瘤坏死因子(TNF)-α 的水平。本文探讨匹多莫德、沙利度胺免疫调节剂能否增强弓形虫W2b2a 表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 弓形虫RH 株为本室传代保种、pcDNA3、pcDNA3-W2b2a 为本室构建。

1.2 实验动物 清洁级昆明小鼠，6 周龄左右，雌雄各半，体重为(20±2)g，购自南华大学实验动物中心。

1.3 主要试剂与药物 HRP 标记的羊抗小鼠IgG购自北京博大泰克公司，FITC-CD4、PE-CD8a 为Bioscience 公司产品;IFN-γ 检测ELISA 试剂盒购自深圳晶美生物有限公司;细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)购自上海美季生物技术有限公司;FREUND 佐剂购自Sigma 公司;匹多莫德为太阳石(唐山)药业有限公司产品;沙利度胺片，25 mg/片，国药准字H32026129，常州制药厂有限公司。

1.4 实验动物分组及动物免疫 昆明小鼠120 只，随机分为6 组，雌雄各半，分别为Ⅰ组:pcDNA3-W2b2a 质粒100 μl、Ⅱ组:pcDNA3-W2b2a 质粒100 μl 加匹多莫德(200 mg/kg/d)、Ⅲ组:pcDNA3-W2b2a 质粒100 μl 加沙利度胺(1.0 mg/只/d)、Ⅳ组:pcDNA3-W2b2a 质粒100 μl 加弗氏佐剂组、Ⅴ组:pcDNA3 100 μl、Ⅵ组:生理盐水100 μl。将定量的匹多莫德、沙利度胺、弗氏佐剂分别与pcDNA3-W2b2a 质粒混合，从小鼠左后腿肌肉注射，每次100 μl，共免疫3 次，每次间隔2 周，生理盐水组和pcDNA3 组作对照。分别于免疫前及末次免疫后第2周、第4 周用断尾法收集小鼠血清备用。

1.5 小鼠血清特异性抗体IgG 检测 按试剂盒操作说明检测各组免疫前及末次免疫后第2 周、第4周免疫鼠血清抗体IgG 水平。

1.6 小鼠血清IFN-γ 测定 小鼠末次免疫后2 周取血清测定IFN-γ，测定方法按试剂盒说明操作。

1.7 小鼠脾细胞悬液制备 小鼠末次免疫后2 周，在攻击实验前，每组小鼠随机处死8 只无菌取脾脏置于200 目铜网，研磨后用1640 培养液冲洗，收集脾细胞，破红细胞后，用含10%小牛血清的1640 培养液吹打混匀，将脾细胞数调整至5 ×106ml-1，用于测定鼠脾细胞T 淋巴细胞亚群。

1.8 鼠脾细胞T 淋巴细胞亚群测定 PBS 调整小鼠脾细胞悬液密度至(1.6～1.9)×106个/ml 于BD公司专用试管中，每只小鼠设两管，1 500 r/min 离心5 min，吸取900 μl 上清;加PE-CD8α、FITC-CD4、PE-Cy5-CD3e 单抗各5 μl，混匀10 s，室温避光放置30 min，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，每管加入2 ml PBS 溶液，混匀10 s，1 500 r/min 离心5 min，弃上清;用PBS 溶液洗涤一次;加1%多聚甲醛100 μl，混匀10 s，在BD FACSCalibur 流式细胞仪上用CELLQuest 软件获取CD4+、CD8+T 淋巴细胞数量，并计算CD4+T 淋巴细胞与CD8+T 淋巴细胞比值。

1.9 免疫鼠脾细胞增殖实验(CCK-8 法) 将各组脾细胞悬液100 μl(2 ×104ml-1)分别加入96 孔细胞培养板(每组设2 个复孔和对照孔)，各组分别加入ConA，(终浓度为10 μg/ml)对照孔加入ConA，37℃，5%CO2培养48 h。于培养结束前4 h 各孔加入10 μl CCK-8 试剂。培养结束后，吸去100 μl 上清，测定时每孔加入二甲亚砜(DMSO)100 μl，振荡溶解，用酶标仪测定吸光度(A450 值)。

1.10 攻击感染实验 末次免疫后第4 周，实验组和对照组小鼠经腹腔注射弓形虫RH 株速殖子(500个/鼠)，观察记录小鼠的感染情况和死亡时间。

1.11 统计学处理 统计数据采用统计软件SPSS11.5 非参数Kruskal-Wallis 检验。以±s 表示，表格采用Excel 制图。

2 结果

2.1 小鼠血清特异性IgG 抗体水平 各免疫组小鼠特异性IgG 抗体均高于对照组(P ＜0.05)，且均于末次免疫后第4 周达到最高值;Ⅱ组pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组、Ⅳ组pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐剂组IgG 抗体水平较Ⅰ组pcDNA3-W2b2a 组和Ⅲ组pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺组同期要高(P ＜0.05)(图1)。

2.2 免疫小鼠血清IFN-γ 检测 按试剂盒提供的IFN-γ 标准品所测OD 值绘制标准曲线，将所测得的小鼠血清OD 值换算成IFN-γ 浓度(pg/ml)(表1)，Ⅱ组pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德、Ⅳ组pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐剂、Ⅲ组pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺小鼠血清IFN-γ 水平明显高于pcDNA3-W2b2a 组和对照组(P ＜0.01)。

图1 ELISA 法检测小鼠血清IgG 的结果Fig.1 Detection of IgG in sera of mice by ELISA

表1 小鼠血清IFN-γ 浓度(pg/ml)、鼠脾细胞亚群检测(%)Tab.1 Detection of concentration of cytokine IFN-γ in serum and leukomonocyte subpopulation of splenoctes from immunized mice

表2 速殖子攻击后各组小鼠存活时间(±s)Tab.2 Survival time of mice in different groups after challenged with tachyzoite(±s)

表2 速殖子攻击后各组小鼠存活时间(±s)Tab.2 Survival time of mice in different groups after challenged with tachyzoite(±s)

Note:Ⅰ.pcDNA3-W2b2a;Ⅱ.pcDNA3-W2b2a and Pidotimod;Ⅲ.pcDNA3-W2b2a and Thalidomid;Ⅳ.pcDNA3-W2b2a and Freund adjuvant;V.pcDNA3;Ⅵ.Nacl;1)compared with control groups，P ＜0.01.

图2 速殖子攻击后各组小鼠存活率Fig.2 Survival rate of mice in different groups after challenged with tachyzoite

2.3 鼠脾细胞T 淋巴细胞亚群测定 小鼠末次免疫后第2 周，取小鼠脾细胞进行T 淋巴细胞亚群测定，pcDNA3-W2b2a 组、pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组、pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺组、pcDNA3-W2b2a加弗氏佐剂组与对照组比较CD4+T、CD8+T 淋巴细胞数量增多;pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐剂组CD4+/CD8+比值明显高于pcDNA3-W2b2a 组和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺组(表1)。

2.4 免疫鼠脾细胞增殖实验(CCK-8) 末次免疫后二周，ConA 刺激小鼠脾T 细胞，免疫组小鼠脾细胞均发生增殖。各组脾细胞增殖活性如下(加ConA孔的A 值与不加ConA 孔的A 值的比值):pcDNA3-W2b2a:1.12，pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组:1.98，pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺:1.34，pcDNA3-W2b2a加弗氏佐剂:2.03，各免疫组脾淋巴细胞增殖能力与两对照组比较明显增强(P ＜0.05)。

2.5 抗攻击感染的免疫保护作用 末次免疫后第四周每只小鼠经腹腔注射500 个弓形虫速殖子，实验小鼠均不能耐受弓形虫攻击感染。疫苗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3 组及生理盐水组(P ＜0.05)，且pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐剂组小鼠存活时间长于pcDNA3-W2b2a 组和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺组(P ＜0.05)，说明匹多莫德能增强弓形虫W2b2a 表位疫苗抗弓形虫感染的免疫力(表2，图2)。

3 讨论

免疫调节剂匹多莫德是一种安全有效的生物反应调节剂，既能促进非特异性免疫反应又能促进特异性免疫反应［2］。动物和人体试验均表明，本品具有良好的安全性和耐受性，克服了生物来源免疫调节剂的不良反应。王为为等［3］研究匹多莫德能够显著激活地塞米松诱导的免疫抑制，抑制地塞米松诱导的小鼠弓形虫隐性感染活化，其免疫调节机制有Th1 和Treg 细胞的参与;国外，Tan 等［4］研究口服匹多莫德对正常和免疫功能低下的小鼠的免疫功能有明显的增强作用，使免疫功能低下时降低的辅助性T 细胞(CD4+)与抑制性T 细胞(CD8+)的比值恢复正常;谢荣华［5］研究证实匹多莫德可增强弓形虫GRA1 蛋白抗弓形虫感染的免疫效果;赵莹等［6］报道匹多莫德具有一定的体外抑制弓形虫速殖子增殖的作用，匹多莫德与磺胺甲恶唑联合应用既能降低磺胺甲恶唑用量又能有效抑虫。沙利度胺是一种合成谷氨酸衍生物，曾名反应停，具有镇静、止吐的作用，后发现该药有强烈致畸而被禁用。2006 年又被批准用于与地塞米松联合治疗多发性骨髓瘤。沙利度胺对多种肿瘤都具有抗血管生成作用，但因其具有过多的不良反应，限制了其长期应用。研究者通过对其化学结构进行改造，开发了新一代的沙利度胺类似物pomalidomide 具有T 细胞共同刺激作用，激活T 细胞特异性免疫反应［7］;沙利度胺可以刺激细胞毒性T 细胞增殖，诱导其分泌具有直接抗肿瘤作用的干扰素γ (IFN-γ)和IL-2［8］。对于沙利度胺的研究还在继续，随着研究的深入，几乎无致畸性的沙利度胺衍生物将会面世。

表位疫苗已在寄生虫疫苗的研究中获得满意的免疫效果［9］，本课题组在前期成功构建弓形虫多表位疫苗pcDNA3-W2b2a 并证实诱导小鼠产生一定的抗弓形虫感染的作用［1］，本次研究结果显示:pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐剂组、pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺组小鼠血清IFN-γ 水平显著高于pcDNA3-W2b2a 组。pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐剂组IgG 抗体水平、CD4+/CD8+比值、T 细胞增殖活性显著高于pcDNA3-W2b2a 质粒组和pcDNA3-W2b2a 加沙利度胺组，免疫组抗体水平均在末次免疫后第四周最高。小鼠攻击试验表明，免疫组小鼠存活时间明显长于对照组(P ＜0.05)，且pcDNA3-W2b2a 加匹多莫德组、pcDNA3-W2b2a 加弗氏佐剂组小鼠存活时间长于其他免疫组。匹多莫德、沙利度胺与弗氏佐剂可增强弓形虫新基因W2b2a 表位疫苗免疫小鼠的保护作用。其中匹多莫德作用接近于弗氏佐剂，但副作用显著低于后者，可望用于弓形虫亚单位疫苗的研制。

［1］谭 逵，张 琼，范久波，等.弓形虫新基因wx2 表位疫苗免疫小鼠的保护研究［J］.中国病原生物学杂志，2008，35(9):1051-1058.

［2］田新平，曾小峰.新型合成免疫调节剂匹多莫德［J］.中国新药杂志，2005，14(1):111-114.

［3］王为为，霍星星，孔兰婷，等.匹多莫德抑制地塞米松诱导的小鼠隐性弓形虫感染的活化［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2013，31(5):385-389.

［4］Tan HR，Dong Q，Cao LZ，et al.The effect of immune-potentiating action and expressing lymphocyte factor of pidotimod［J］.J Beijing Med Univ，1999，31(2):38-41.

［5］谢荣华.匹多莫德增强弓形虫GRA1 蛋白免疫效果的动物实验评价［J］.中国免疫学杂志，2011，27(8):748-750.

［6］赵 莹，吕芳丽.匹多莫德体外抑制弓形虫增殖作用的研究［J］.热带医学杂志，2013，13(5):531-534.

［7］Dredge K，Marriott JB，Todryk SM，et al.Protective antitumor immunity induced by a costimulatory thalidomide analog in conjunction with whole tumor cell vaccination is mediated by increased Th1-type immunity［J］.Immunol，2002，168(10):4914-4919.

［8］任岩松，沈舜义.老药新用在新药研发中的意义［J］.世界临床药物，2013，34 (11):687-691.

［9］范久波，吴 翔，谭 逵，等.弓形虫新基因表位疫苗效果的观察［J］.中国病原生物学杂志，2008，3(6):421-424.