转染Elafin 对百草枯诱导的肺泡上皮凋亡的影响①

秦开秀 宗建春 方 艳 王晓龙 (重庆医科大学附属第二医院急救部，重庆 400010)

百草枯(Paraquat，PQ)是一种强力快速的接触性除草剂，对人体具有极大危害性。PQ 能被肺泡上皮细胞主动摄取，在肺组织聚集后，经NADPH 辅助的单电子还原为自由基，引起脂质过氧化等一系列链锁反应，直接损害肺泡上皮。此外，PQ 还可诱导肺泡上皮出现凋亡，进而进一步影响肺组织结构及功能，导致不可逆损伤［1］。因此，防止PQ 诱导的肺泡上皮凋亡是PQ 中毒治疗中重要一环。

Elafin 作为肺泡上皮分泌的小分子多肽，具有抗炎、抗氧化、气道上皮修复等多种功能［2］。本研究旨在通过转染Elafin 进入肺泡上皮细胞(A549)，探讨其对PQ 中毒下的A549 保护作用及可能机制，为PQ 中毒治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材料 pEGFP-C1-Elafin 为本室保存，RT-PCR试剂盒为大连宝生物公司产品。Annexin V-FITC/PI试剂盒，活性氧类物质(Reactive oxygen species，ROS)ROS OxiSelectTM 检测试剂盒为美国细胞生物实验公司产品。核因子相关因子2(nuclear factor erythroid like-2，Nrf2)，血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)单克隆抗体购自Santa Cruz 公司。

1.2 Elafin 转染入A549 细胞，并检测Elafin mRNA表达 以转染生理盐水水为对照组(Control group，C 组)，转染pEGFP-C1-Elafin 为实验组(Experim-ental group，E 组)，转染pEGFP-C1 为空质料对照组(Empty plasmids control group，EP 组)。Elafin 转染参照文献［2］进行，脂质体转染后细胞置于37℃孵箱培养6 h，吸弃转染液，每孔加入10%胎牛血清培养基2 ml，继续培养12～24 h 后进行后行Elafin RT-PCR 检测。

参照RT-PCR 说明书进行。Primer 5.0 软件设计引物，上海生工合成，序列如下:引物1:5'GACGAATTCTAGAGGGCCAGCTT3';引物2:5' ATTGCGGCCGCTCACTGGGGAACGAAACA3'。PCR 反 应 条 件 如下:95℃预变性5 min;95℃变性1min，67℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 个循环;最后72℃延伸1 min。

1.3 A549 存活率的检测 应用荧光素标记的Annexin V-FITC/PI 试剂盒进行检测。培养的A549 细胞用冰冷的PBS 冲洗2 遍，再用结合缓冲液悬浮。然后按照说明书加入Annexin V-FITC 和PI 进行标记，1 h 后上流式细胞仪检测。以Annexin V-FITC和PI 均为阴性表示存活细胞，存活细胞占检测细胞总数的百分比为存活率。

1.4 ROS 的检测 首先吸除中性粒细胞培养液，DPBS 冲洗3 次，加入100 μl 1 × DCFH-DA 37℃培育45 min，再予DPBS 冲洗3 次，流式细胞仪于488 nm 激发光波长下检测荧光强度。

1.5 Nrf2、HO-1 蛋白表达的检测 蛋白提取液提取A549 细胞蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量。40 μg 提取蛋白于12% SDS-PAG 上电泳，然后半干转移至硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉封闭，加入Nrf2、HO-1 单克隆抗体(1∶1 000)，以β-actin 作为内参照，4℃过夜。1∶5 000 辣根过氧化酶标记的二抗处理后，用化学发光法进行检测。测得结果与内参照相比的比值作为最终结果。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测Elafin mRNA 表达 转染重组质粒pEGFP-C1-Elafin 后12、24 h，RT-PCR 检测Elafin mRNA 表达，以证实转染成功与否。图1 表明，转染重组质粒后阴性对照组24 h 未见Elafin 表达，而实验组在12、24 h 均出现目的条带。

2.2 A549 存活率的检测 分别以5、50、100 μmol/L PQ 作用A549 细胞24～72 h，检测其存活率。从图2A 可以看出，与C 组相比，5 μmol/L PQ 对A549 存活率无明显影响，50、100 μmol/L PQ 与A549 分别作用24、48 h 后即可见对其毒性影响。后续实验选浓度100 μmol/L PQ 进行，E 组24 h 时起即可见与PQ 组存在统计学差异，PQ 组与C 组、PQ +EP 组与C 组在各时点上均存在显著性差异(图2B)。

2.3 ROS 的检测 ROS 是PQ 中毒的重要物质之一，本次研究也发现，PQ(100 μmol/L)与A549 作用24 h 及以后ROS 含量较C 组显著升高，而给予Elafin重组质粒共培养后(PQ +E 组)ROS 含量较PQ 组下降，而空质粒组(PQ +EP)与PQ 组无显著差异(图3)。

2.4 Nrf2、HO-1 蛋白表达的检测 我们首先检测了100 μmol/L PQ 对Nrf2、HO-1 表达影响(图4A)，Nrf2与HO-1 在3 h 较对照组(0 时点)明显升高，而12 h较3 h 显著下降。然后检测了Elafin 对Nrf2、HO-1 表达影响(图4B)，转染Elafin 24 h 后，再予100 μmol/L PQ 作用A549 24 h，PQ 可以明显抑制Nrf2、HO-1 表达;而转染Elafin 组可上调这种表达，且较PQ 组有统计学差异，空质粒组未呈现上述现象。

图1 Elafin mRNA 表达检测Fig.1 Detection of Elafin mRNA

图2 PQ 对A549 凋亡的影响Fig.2 Effect of PQ on A549 apoptosis

图3 Elafin 抑制PQ 诱导的ROS 产生Fig.3 Elafin inhibited ROS production induced by PQ

图4 PQ 及Elafin 对Nrf2、HO-1 表达影响Fig.4 Effect of PQ and Elafin on expression of Nrf2、HO-1

3 讨论

PQ 诱导产生的ROS 是PQ 高致死的首要原因。一方面，ROS 也可促进肺泡上皮凋亡而加速肺损伤［1］;同时，我们研究发现［3］，ROS 可以作为第二信使延长PQ 状态下中性粒细胞凋亡，进而加重炎症反应。因此，ROS 成为PQ 中毒治疗的重要靶点。

本研究发现，PQ(100 μmol/L)与A549 作用24 h 及以后ROS 含量较C 组显著升高，而50、100 μmol/L PQ 与A549 分别作用24、48 h 后其凋亡率较对照组明显升高，但5 μmol/L PQ 与对照组未见明显差异。因此，PQ 呈一定程度浓度依赖性促进ROS 产生及A549 细胞凋亡。

作为小分子阳离子多肽，Elafin 除具有抗氧化、抗炎外，还有肺泡上皮保护等作用。研究表明［4，5］，Elafin 在肺泡上皮保护方面有天然优势，可以通过保护上皮紧密连接相关蛋白1(Zonulaoc cludens-1，ZO-1)、生物被膜层以及巨噬细胞表面受体CD14 等机制保护肺泡上皮。转染Elafin 后，12 h 即可见mRNA 表达，说明转染成功。转染组与PQ 刺激较单纯PQ 组ROS 含量明显下降，A549 凋亡率减少。证实Elafin 可以通过抑制ROS 产生而降低A549 细胞凋亡。实验同时进行了空质粒对照，未发现其对ROS、A549 凋亡等影响，则可排除空质粒对实验可能的干扰。

业已证实［6］，Nrf2 和HO-1 是体内最重要的抗氧化反应转录因子及其下游酶蛋白。为进一步检测Nrf2 及HO-1 是否参与Elafin 对PQ 诱导的A549 凋亡抑制过程，我们首先检测了100 μmol/L PQ 对Nrf2、HO-1 表达影响。PQ 作用后，Nrf2 及HO-1 呈现一过性升高，而后很快下降。Nrf2 作为体内重要的抗氧化反应元件，氧化应激是其最强的刺激因素。ROS等氧化应激因子启动Nrf2 转录，产生HO-1 等抗氧化蛋白，从而负反馈调节ROS 等的副反应。然而，此次实验研究发现，PQ 条件下的Nrf2 及HO-1 只能呈现一过性升高，进而不能持续抑制ROS 作用;而转染Elafin 后，可较长时间促进Nrf2、HO-1 表达。

因此，转染Elafin 进入A549 细胞，可能通过持续上调Nrf2 及HO-1 表达，而抑制ROS 产生，进而减轻PQ 对肺泡上皮细胞的毒性，达到保护肺泡细胞的目的，为探索PQ 中毒治疗提供了一种新的思路。

［1］Dini Oliveira RJ，Sousa C，Remião F，et al.Sodium salicylate prevents paraquat-induced apoptosis in the ratlung［J］.Free Radic Biol Med，2007，43(1):48-61.

［2］王晓龙，周向东.转染重组Elafin 对炎症状态下巨噬细胞表面受体CD14 的保护作用［J］.暨南大学学报(医学版)，2011，32(4):393-396.

［3］Wang XL，Lou FL，Zhao HG.Paraquat-induced reactive oxygen species inhibit neutrophil apoptosis via a p38 MAPK/NF-kB-IL-6/TNF-a positive-feedback circuit［J］.PLoS ONE，2014，9(4):e93837-93843.

［4］Li Q，Zhou XD，Nie XH，et al.The role of recombinant human elafin in the resistance of A549 cells against Pseudomonas aeruginosa biofilm［J］.Respiration，2010，79(1):68-75.

［5］Li Q，Zhou XD，Xu XY，et al.Recombinant human elafin protects airway epithelium integrity during inflammation［J］.Mol Biol Rep，2010，37(1):2981-2988.

［6］Itoh K，Chiba T，Takahashi S，et al.An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase Ⅱdetoxifying enzyme genes through antioxidant response elements［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，236(2):313-322.