人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL 适配子筛选及结构分析①

平 娟 赵 娜 申智慧 阴明星 张 倩 张 伟 马雪姗 陈传波

(河南大学淮河临床学院，开封 475001)

慢性粒细胞白血病(CML)是一种发生在骨髓和造血干细胞以粒细胞增殖为主要特征恶性克隆性疾病，它的特点是产生大量不成熟的白细胞，这些细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的造血功能，并能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等症状［1-3］。长期以来，该病一直成为困扰医学工作者的一个难题。因此，探讨有效的预防和治疗慢性粒细胞白血病的新策略和方法是目前慢性粒细胞白血病研究的关键课题。目前，大部分国内外研究证实，95%的患者骨髓中可以找到Ph染色体，即特征性染色体异位t(9;22)，(q34;q11)及融合基因bcr/abl，融合基因表达融合蛋白BCRABL，其中BCR-ABL 融合蛋白能激活酪氨酸激酶的活性，和白血病的发病密切相关［4，5］。2011 年，国内著名学者王前飞研究员在国际著名杂志《Blood》上发表了有关融合蛋白在白血病中致病机制的最新研究成果，揭示了融合蛋白通过选择性调控部分融合蛋白的部分靶基因而推动白血病的发生，这是目前国内首次报道了白血病也和融合蛋白有直接的关系［6］。

指数富集配基系统技术(SELEX)是20 世纪90年代初期发展起来的一种研究核酸结构和功能的有效方法，其基本原理是化学合成一个单链核苷酸文库，库容量大约1013～1018，常用的初始文库可以是修饰的或者未修饰的RNA，单链DNA(ssDNA)或者双链DNA 文库，由两端固定序列及中间30-90 个随机碱基构成［7］，在理论上每个合适的文库在适宜条件下都会有一定数量特定序列和靶分子结合，将结合序列和未结合序列分开以后以PCR 扩增得到富集后次级文库，经反复的结合、分离、扩增等步骤，实现靶分子特异性结合序列的指数级富集［8，9］，基于上述思想，CML 的发病机制95%以上和融合蛋白及融合基因有关，本研究应用SELEX 技术首次进行融合蛋白BCR-ABL 适配子(aptamer)筛选，以期达到对融合蛋白BCR-ABL 的封闭表达作用，从而起到治疗和预防慢性粒细胞白血病CML 的目的，为临床上治疗和预防该疾病提供一个新方向。

1 材料与方法

1.1 材料 BCR-ABL 融合蛋白(为大肠杆bcr-abl菌基因重组蛋白，纯度＞95%)，T4DNA 连接酶TaqDNA 聚合酶，T4 多核苷酸激酶，DNA 提取试剂盒，链亲和素磁珠(promega 公司)，BSA，Hepes(北京华美生物技术股份有限公司)，异硫氰酸胍(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，DNA marker(美国sigma 公司)，硝酸纤维素膜(0.60 μm，HAWP，Millipore)，DYY-6C 琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一仪器厂)，DNA 随机文库(由上海生工合成):构建长度为90 bp 的随机DNA 文库，两端为固定序列，中间随机序列为44 个碱基，库容量大约1018，P90 库:5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGF-(N44)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT-3'，上 游 引物:5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'，下 游引物:5' 端标记生物素5'-Biotin-ATCCGCCTGATTAGCGTACT-3'，下游测序引物:5'-TCCGCCTGATTAGCGTACT-3'，5'端标记或者不标记生物素，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 SELEX 筛选 BCR-ABL 融合蛋白包被于96 孔酶联板上，4℃过夜，包被液以0.05 mol/L NaHCO3，pH 为9.2 的缓冲液，同时设空白对照孔和融合蛋白包被孔，其中空白对照孔以3% BSA 37℃封闭4 h，随机ssDNA 文库与一定量的tRNA 先在结合缓冲液(SHCMK 液:20 mmol/L Hepes pH7.3，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2)中经与3%BSA 封闭的空白对照组37℃结合30 min，去除和BSA 结合的ssDNA，转移到BCR-ABL 融合蛋白孔和融合蛋白结合40 min，然后用缓冲液(SHCMK 液+吐温20)洗涤6 次，洗去未结合的ssDNA，再加洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，4 mmol/L 异硫酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3)于80℃作用10 min，洗脱下与融合蛋白BCRABL 结合的ssDNA，经酚:氯仿抽提、乙醇沉淀，将ssDNA 溶解于20 μl 的TE 缓冲液中，接着将ssDNA扩增成一端带有生物素的dsDNA，PCR 反应体系为:模板5 μl，10 ×PCR 缓冲体系10 μl，MgCl26 μl，dNTPs 100 μmol/L，Taq 酶2 U，上游引物、下游引物5'端各标记生物素引物100 pmol/L，加去离子水至100 μl，PCR 反应体系为:94℃预变性3 min，然后进行24 个循环94℃变性30 s，60℃复性1 min，72℃延伸2 min，最后72℃延伸7 min，一端带有生物素的dsDNA 通过生物素-链亲和素之间的作用与链亲和素磁珠结合，经结合缓冲液洗涤3 次后，用0.15 mol/L NaOH 37℃变性15 min，使不带生物素的一条ssDNA 从链亲和素磁珠上洗脱下来，经无水乙醇沉淀，TE 缓冲液溶解，测定A 值，用作下一轮筛选的ssDNA 文库，如此反复进行11～15 轮。

1.2.2 文库与BCR-ABL 融合蛋白结合率的测定 每轮SELEX 筛选的产物用标记生物素的引物进行PCR 扩增后，PCR 产物用苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀后，测定其吸光度值，取1 μg PCR 产物在100 μl 结合缓冲液中95℃变性2 min，与等物质的量的融合蛋白结合反应30 min，弃上清，用200 μl 缓冲液冲洗融合蛋白-磁珠-ssDNA 复合物5～7 次，四甲基联苯胺显色，终止后用酶联仪测定D450 nm 值，每轮平行测定3 管，取平均值。

2 结果

2.1 融合蛋白各步骤SELEX 筛选结果 以融合蛋白BCR-ABL 为靶标，进行13 轮筛选，各轮所加融合蛋白，ssDNA 文库及每轮PCR 扩增的最适循环数和ssDNA 与融合蛋白的结合百分率见表1，经过13 轮筛选后，分别测定第1、3、6、9、13 轮文库与融合蛋白的结合比例，测定结果显示:随着筛选轮数的增加，第3 轮明显的提高达4.5%，第6 轮达16.3%，第11 轮达31.0%，第13 轮达47.1%，继续筛选2-5轮后结合率没有明显的提高，见表1、图1。

2.2 寡核苷酸适配子的克隆、测序及其一级结构分析 第11 轮筛选出ssDNA 适配子群用不带生物素的引物进行PCR 扩增，PCR 产物经纯化回收后进行克隆，随机挑选24 个克隆进行序列分析，用5'端标记的生物素的引物扩增纯化后，随机分为ABC 三群，各群有8 个克隆子，进行适配子和融合蛋白亲和性试验，A 群中的适配子A2、A6、A7 与融合蛋白亲和力最强，A 值达1.42，B 群中B1、B4、B6 与融合蛋白亲和力最强，A 值达1.34，C 群中C3、C5 与融合蛋白BCR-ABL 亲和力最强，A 值达1.33，亲和性较好的适配子群结构中含有可以构成茎环或者凸环结构的序列。见表2，一级序列结构分析表明，所有序列无共同的保守序列，但都含有共同的保守序列TAGTCGGTAA、TGGTCGGTAA、AGGCTGGT 等，这对形成茎环或凸环结构有一定意义。见表3。

2.3 寡核苷酸适配子二级结构分析 对所有亲和力较高的序列用DNA folding 进行最低能量二级结构分析，所有寡核苷酸适配子的二级结构主要可以归纳为以下几类:5'端和3'端各有一个小茎环结构，随机序列区域形成一个大的茎环结构，3'端与随机序列区形成一个茎环和凸环结构，5'端有一个茎环结构，5'端和3'端分别与随机序列形成2～3 个连续的茎环序列。结果显示，所有二级结构的特点是茎环结构或凸环结构。

表1 各步融合蛋白BCR-ABL 适配体筛选结果Tab.1 SELEX screening results of each round of BCRABL fusion protein aptamer

图1 适配子对融合蛋白BCR-ABL 的结合作用Fig.1 Combination of oligonucleotide to BCR-ABL fusion protein

2.4 寡核苷酸适配子与BCR-ABL 融合蛋白Kd值测定 结构根据一级结构和二级结构的特点，测定8 个寡核苷酸适配子和融合蛋白的亲和力，通过Sctachard 作图分析测定寡核苷酸适配子的Kd 值，适配子A2、A6、A7、B1、B4、B6、C3、C5 与融合蛋白BCR-ABL 的亲和力分别为72、89、120、210、230、360、430、890 nmo/L。由于亲和力和Kd 值成反比，所以Kd 值越小，亲和力越高，因此适配子A2 与融合蛋白BCR-ABL 的亲和力最高，达72 nmo/L。

表2 适配子对融合蛋白BCR-ABL 的亲和性Tab.2 Affinities of aptamers binding to BCR-ABL fusion protein

表3 A2，A6，A7，B1，B4，B6，C3，C5 适配子群测序结果Tab.3 Sequences of aptamers of A2，A6，A7，B1，B4，B6，C3，C5

3 讨论

融合蛋白BCR-ABL 是融合基因bcr-abl 编码的一种具有酪氨酸激酶活性的蛋白，并呈现不同的表型，是CML 发病的基础［10］，白血病基因异位后产生的融合蛋白是白血病特有的分子标记，融合前期各蛋白均在血细胞正常代谢或者分化中起一定的作用，异位融合蛋白所形成的融合蛋白具有促进增殖和分化作用，白细胞的一些转录因子在融合前，对血系干细胞分化为正常白细胞有重要作用，在异位融合发生后，所形成的异位融合蛋白转录调节因子融合蛋白多具有促进增殖和抑制分化作用［11，12］，融合蛋白从生物学角度来讲主要有两类:一类是具有酪氨酸激酶作用的异位融合蛋白如BCR-ABL、TELPDGFR、NPM-ALK、LYN 等异位融合蛋白，另一类是具有抑制造血转录调控的异位融合蛋白即血液特异性转录因子调节融合蛋白，如AML/MTG8、TEL/AML 等，大量的研究表明针对酪氨酸激酶作用的融合蛋白干扰可显著降低白血病细胞的增殖，对白血病特异性转录调节因子融合蛋白干扰可降低白血病细胞的增殖并促进其分化，由于靶向白血病特异性转录调节因子融合蛋白不仅可以抑制白细胞的增殖，而且还能促进其分化，因此针对转录调节因子融合蛋白靶向研究越来越受重视［13，14］，本文利用SELEX 技术来筛选慢性粒细胞白血病融合蛋白BCRABL 适体，以期筛选出来的高亲和性寡核苷酸片段能够特异性的封闭融合蛋白BCR-ABL 的表达，达到治疗和预防慢性粒细胞白血病的目的，为临床上治疗该疾病提供一个新的研究方向。

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