膜表达型InsB15-23H-2Kd dtSCT 对NOD 小鼠1 型糖尿病发病的影响

潘兴元 陈则东 窦 延 梁 锴 余鸣鸣 季明春

(扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室，扬州 225001)

1 型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1D)是由T 淋巴细胞介导的，以胰岛β 细胞损伤为主要特征的器官特异性自身免疫疾病，目前仍无有效的根治方法［1］。非肥胖型糖尿病小鼠(Nonobese diabetic，NOD)能自然发生1 型糖尿病，从12 周龄时开始出现明显糖尿病症状，至30 周龄时雌性小鼠累计发病率可达到80%。并且与人类似，在疾病早期(4～5周龄)发生胰岛炎，进行性破坏胰岛β 细胞，是目前研究1 型糖尿病的主要动物模型之一［2，3］。

在NOD 小鼠1 型糖尿病病程中，CD8+细胞毒T 细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)发挥着重要作用［4］，特别是启动抗原胰岛素(insulin)特异性的CTLs 更是研究热点之一［1］。insulin B15-23(简写为InsB15-23)是H-2Kd限制性的优势表位［5］，但它与H-2Kd的亲和力很低。为了研究InsB15-23表位在T1D病程中的作用，我们引入了二硫键陷阱单链三聚体(disulfide trap single chain trimer，dtSCT)技术［6，7］，来提高InsB15-23的稳态肽占位水平(level of steadystate peptide occupancy)。我们用前期构建的膜表达型InsB15-23H-2KddtSCT (简写为InsB15-23mdtSCT)真核表达载体皮下免疫3 周龄母鼠，观察其对NOD小鼠血糖和发病情况的影响。

1 材料与方法

1.1 小鼠 3 周龄SPF 级NOD/ShiLtJ 雌性小鼠购自南京大学国家遗传工程小鼠资源库，在SPF 条件下饲养，所用饲料、饮水与垫料均经高压灭菌处理，实验所有操作均在无菌超净工作台内进行。操作都符合实验动物福利。

1.2 免疫小鼠 24 只3 周龄的NOD 母鼠随机分为两组，每组12 只。实验组小鼠首免使用50 μg InsB15-23mdtSCT 加等体积的弗氏完全佐剂，接种于NOD 小鼠右后肢外侧皮下;1 周以后，用50 μg InsB15-23mdtSCT 加等体积的弗氏不完全佐剂，于相同部位行第二次免疫;距二次免疫后一周进行第三次免疫，方法与第二次接种相同。对照组采用pcDNA3.1(-)空载体，方法同实验组。

1.3 NOD 小鼠的血糖监测 从10 周龄开始，采用三诺公司的安稳血糖仪检测小鼠血糖，每周监测一次，直到30 周。每次检测前对NOD 小鼠行6 h 的禁食处理，并更换垫料，防止小鼠采食食物残渣对血糖测定值造成干扰。

1.4 胰岛单个核细胞浸润分析 取3 周龄的NOD母鼠4 只，随机分为两组，同法免疫。7 周龄时处死小鼠，取胰腺制成石蜡切片。取连续切片置于显微镜下观察，分别统计0～1/4 浸润、1/4～1/2 浸润、1/2～3/4 浸润、3/4～完全浸润的胰岛个数，并作统计分析。

1.5 IGRP206-214H-2KddtSCT 四聚体的制备 胰岛细胞特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(Islet glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein，IGRP)是1 型糖尿病病程晚期的重要抗原，其H-2Kd限制性表位是IGRP206-214［1］。为了研究InsB15-23mdtSCT 分子影响1 型糖尿病病程的细胞学机制，我们制备了IGRP206-214H-2KddtSCT 四聚体来监测NOD 小鼠IGRP206-214特异性CTLs 的变化。方法参照本实验室可溶性dtSCT 四聚体制备方法。简而言之就是通过SOE-PCR 将InsB15-23抗原肽、β2m和H-2Kd胞外区依次相连，并在H-2Kd的84 位引入一个酪氨酸-半胱氨酸(Y84C)突变，与linker1 中的半胱氨酸形成分子内二硫键，帮助抗原肽更好地与抗原结合槽结合［8］。同时在H-2Kd胞外区3'端加上可生物素化Avitag(GGGLNDIFEAQKIEWHE)序列［9］，在5'端和3'端分别加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，克隆入pET-22b 原核表达载体中。经过原核表达、洗涤包涵体、纯化包涵体、稀释复性得到IGRP206-214H-2KddtSCT 单体，再将单体生物素化后与PE 荧光素标记的streptavidin 按4∶1比例混合制备成四聚体。

1.6 流式检测 先标记APC-mCD8α 单抗，再标记IGRP206-214H-2KddtSCT 四聚体。用含有0.5%FBS的PBS 洗3 次后在BD Calibur 上进行检测。同周龄的BALB/c 小鼠作为阴性对照来检测非特异性标记水平。

1.7 统计学分析 用GraphPad Prism 软件进行数据分析。

2 结果

2.1 InsB15-23mdtSCT 能够降低NOD 小鼠T1D 的发病率 因为实验周期较长，期间有部分小鼠意外死亡，统计最终结果时InsB15-23mdtSCT 组还剩11 只，pcDNA3.1(-)组还剩10 只。由图1A 可见，30 周龄时两组小鼠的平均血糖有显著差异(P ＜0.05)，InsB15-23mdtSCT 组中91%(10/11)NOD 小鼠的血糖值低于阈值(13.9 mmol/dl，即250 mg/L)，而pcDNA3.1(-)组这一比例仅40%(4/10)。由图1B 可见，InsB15-23mdtSCT 组NOD 小鼠的发病率是9%，显著低于pcDNA3.1(-)组的60%和自然发病组的80%。由此可见InsB15-23mdtSCT 具有保护NOD 小鼠，降低其糖尿病发生率的作用。

2.2 过表达InsB15-23mdtSCT 降低NOD 小鼠胰岛浸润淋巴细胞 我们通过连续切片的方法，系统地检查NOD 小鼠每个胰岛的浸润情况，发现InsB15-23mdtSCT 处理组的细胞浸润程度降低，0～1/4 浸润胰岛的比率明显多于pcDNA3.1(-)组;而1/4～1/2、1/2～3/4、3/4～1 浸润胰岛的比率均显著减少(图2)。由此可见InsB15-23rndtSCT 具有减轻炎性细胞浸润，保护胰岛的作用。

图1 30 周龄时NOD 小鼠的血糖及发病率Fig.1 Blood sugar value and morbidity of NOD mice in 30 weeks

图2 胰岛浸润情况Fig.2 Infiltration of islets

图3 InsB15-23mdtSCT 过表达对NOD 小鼠外周血IGRP206-214特异性CTLs 频率无影响Fig.3 Overexpression of InsB15-23mdtSCT does not influence frequency of IGRP206-214specific CTLs in PBMC

2.3 InsB15-23mdtSCT 通过IGRP206-214非依赖性途径来保护NOD 小鼠 在1 型糖尿病的发生与发展过程中存在着抗原表位扩展的现象［4］，因此针对上游的抗原进行免疫干预，势必会干扰到下游抗原的暴露，进而影响到相应抗原特异性CTLs 的水平和疾病的发展。InsB15-23特异性CTLs 大约在4～5 周龄时最多［10，11］，是T1D 进程中起始抗原特异性CTLs，数量较少;而IGRP206-214特异性CTLs 是目前发现的1 型糖尿病后期的重要自身反应性CTLs，往往就在发生糖尿病前达到高峰［12］。那么InsB15-23mdtSCT对NOD 小鼠的保护作用是通过影响IGRP206-214特异性CTLs 水平来实现的吗?我们发现16 周龄、40 周龄的NOD 小鼠外周血中IGRP206-214特异性CTLs 的频率都和pcDNA3.1(-)组均无显著差异，但都与阴性对照BALB/c 有显著或极显著差异(图3)，说明我们自制的四聚体是有效的，并且InsB15-23mdtSCT 是通过IGRP206-214非依赖性机制来保护NOD小鼠的。

3 讨论

NOD 小鼠饲养于本实验室的IVC 笼盒中，严格按照IVC 操作规范进行饲养管理。在交配繁殖工作中，通过血糖测定选取血糖值明显偏高的小鼠进行交配繁殖，防止糖尿病性状的丢失。通过对本实验室截止至30 周龄的NOD 小鼠分析发现，母鼠的发病率为80%，公鼠的发病率为22.2%，与美国杰克逊实验室公布的数据基本一致。

CTLs 在NOD 小鼠1 型糖尿病病程中有着重要作用，β2mnullNOD 小鼠不表达MHCⅠ类分子，CTLs缺失，结果完全不发生1 型糖尿病，甚至连胰岛炎都100%不发生［13，14］。有报道表明CTLs 在1 型糖尿病除了晚期的各个时期都是必需的，尤其对NOD 小鼠早期疾病的引发以及自身反应性CD4+T 细胞的扩增是必不可少的［15，16］。在疾病的发生和发展过程中会出现多种自身抗原，存在表位扩展的现象。其中胰岛素作为疾病进程中早期的关键性抗原，对于其他抗原的暴露及相应CTLs 的诱导有着关键作用。用编码preproinsulinⅡ、proinsulinⅡ、insulinⅡ的质粒免疫NOD 小鼠，都可以加速T1D 的发病［17］，所以我们将关注点集中在胰岛素特异性CTLs，也就是InsB15-23特异性、H-2Kd限制性CTLs 上，研究其在1型糖尿病病程中的作用。

以往这方面的研究往往用流式分选出InsB15-23特异性CTLs，再过继转移给NOD·SCID 小鼠或经半致死剂量辐照的NOD 幼龄小鼠［5］，因为受体小鼠都是免疫缺陷的，并且是将CTLs 单独过继给受体小鼠，所以这种方法不是严格的体内实验，不能反映NOD 小鼠体内的真实情况。还有一种常用的方法是用人工合成的InsB15-23肽来免疫NOD 小鼠。这种方法较为简便，但合成肽存在纯度问题，哪怕是99.9%纯度的肽中也必然混有其他抗原肽，而其中一些强免疫原性的痕量杂肽就有可能导致错误的结果［18］。基于以上考虑，我们决定用真核表达质粒来免疫动物。因为InsB15-23肽的低亲和力，我们采用dtSCT 技术来提高肽与H-2Kd分子抗原结合槽的亲和力。

DNA 疫苗最常用的免疫途径是肌肉免疫。肌肉组织里抗原递呈细胞极少，主要是肌细胞摄取并表达抗原，但肌细胞缺乏共刺激分子，在诱导CTLs应答中并不起直接作用，而是合成抗原并通过某种方式释放到细胞外，供抗原递呈细胞摄取(交叉激活)［19］。我们的dtSCT 分子在细胞内“预装配”，需要直接表达，而不是经过加工递呈，所以我们选择了皮下免疫。

因为dtSCT 分子在细胞内“预装配”，有效地绕过细胞对抗原处理和提呈过程中的各种限制，可以提高抗原提呈的效率，展示出了活化CTLs 的良好前景［20］。本实验室前期的工作也发现InsB15-23mdtSCT 分子能够在真核细胞膜表面展示，并可以提高NOD 小鼠外周血和脾脏中InsB15-23特异性CTLs的频率(另文发表)，所以我们初始的预期是InsB15-23mdtSCT 真核表达载体会加速疾病的进程。然而，在本研究中却发现InsB15-23mdtSCT 具有降低NOD 小鼠1 型糖尿病发病率的作用。我们检查了胰岛浸润情况，发现免疫InsB15-23mdtSCT 的NOD 小鼠胰岛单个核细胞的浸润确实减轻了。这可能由于我们构建的InsB15-23mdtSCT 是由强启动子CMV 控制的，免疫动物后短期内能产生过量的抗原信号，导致CTLs 的活化后凋亡，尚需进一步的实验来验证。并且，我们还发现InsB15-23mdtSCT 对小鼠的保护作用并不是通过IGRP206-214依赖性机制来发挥作用的，具体的机制很值得我们深入研究。

我们在实验中还发现，pcDNA3.1(-)对照组的发病率略低于自然发病率，这可能是由于弗氏完全佐剂对NOD 小鼠免疫系统的干预引起的［21］。但在我们的实验中，两组小鼠初次免疫都使用了弗氏完全佐剂，对小鼠的影响是相同的，两组小鼠发病率的差异是由于免疫不同的真核表达质粒造成的。

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